Drosophila melanogaster Over Diseksiyonu: Ex Vivo Doku Hazırlığı İçin Bir Teknik

Bu makalede

Özet

Kaynak: Parker, D. J., et al. Drosophila Yumurtalıklarında Mitokondriyal Yapı ve İşlevin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, Drosophila yumurtalığının genel anatomisini açıklar ve canlı veya sabit görüntüleme için yumurtalıkları diseksiyon yöntemini içerir.

Protokol

Bu protokol, Parker ve ark., Drosophila Yumurtalıklarında Mitokondriyal Yapı ve İşlevin İncelenmesi, J. Vis. Exp. (2017).

1. Drosophila'nın hazırlanması (gerekli araçlar Şekil 1 A'da gösterilmiştir)

Açıklanan deneylerden herhangi biri için, eklosiyondan sonraki 5 gün içinde Drosophila'yı (oda sıcaklığında veya 25 ° C'de tutulur) toplayın ve bunları 5-7 mL Drosophila gıdası ile doldurulmuş bir şişeye yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız), her şişede en fazla 25 sinek ile; 2: 1'lik bir dişi: erkek oranını koruyun.
Drosophila yumurta üretimini teşvik etmek için az miktarda granül maya serpin. 2-4 gün içinde deneysel manipülasyon yapın.

2. Drosophila Yumurtalıklarının Diseksiyonu (gerekli aletler Şekil 1A)

Böcek diseksiyon ortamını (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığına, 25 ° C'ye kadar ısıtın. Her bir oyukta 200 μL ortam ile sekiz oyuklu bir cam diseksiyon kabının üç kuyusunu doldurun.
Drosophila'yı CO₂ ile uyuşturun, üfleme tabancasının iğnesini flakon tapasının altına yerleştirerek. Onları bir sinek pedine yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, 5 dişiyi ayırın ve onları diseksiyon kabının ilk kuyusuna yerleştirin. Canlı mikroskopi gerçekleştirirken her seferinde bir Drosophila'yı kullanın.
Diseksiyon mikroskobunun göz merceğinden bakarken, iki çift forseps kullanarak göğüs kafesi karından ayırın. Forsepsleri kullanarak, karınları dikkatlice yemeğin ikinci kuyusuna aktarın.
Karnı arka uçta tutmak için bir çift forseps kullanın ve diğer forseps çifti ile yumurtalıkları (diğer karın içeriği ile birlikte) yavaşça dışarı itin. Bu girişim başarısız olursa, yumurtalıkları serbest bırakmak için forsepsleri ön uca sokarak karın dış iskeletini dikkatlice çıkarın.
Forsepsleri kullanarak, tek bir yumurtalığı opak arka ucundan (yani yumurta sarısı dolu, geç evre yumurtalar) tutun ve canlı mikroskopi için işlemek veya immün boyama yapmak üzere sabitlemek için dikkatlice yemeğin üçüncü kuyusuna taşıyın.
Bir çift forseps ile arka ucundan tutarken, her bir yumurtalığın arkasından ön ucuna doğru hafifçe bir alay iğnesi süpürerek koruyucu kılıfı yumurtalıkların etrafından dikkatlice çıkarın.
NOT: Alay sırasında hasarı en aza indirmek için, iğne ucunu bükün ve mikroskobun büyütmesini artırarak her bir yumurtalığı yakınlaştırın (Şekil 1A). Alay etmek, kılıfı kıracak kadar etkili olmalı, ancak yumurtalıkların bütünlüğünü korumak için de dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1: Deney Planı ve Hazırlanması. (A) Açıklanan yöntemlerde kullanılan aletler: A. Sinek şişesi; B. Böcek diseksiyon ortamı; C. Paraformaldehit; D. Sinek fırçası; E. Diseksiyon tabağı; F. Camı örtün; G. Mikrofüj tüpü. H. Cam tabanlı tabak; I. Cam slayt; J. 1.000 μL mikropipet; K. 200 μL mikropipet; L. 2,5 μL mikropipet; M. Bükülmüş uçlu alay iğnesi (uç büyütülür); N. Kalın forseps; O....