Bu protokol, Eidhof ve diğerleri, Drosophila Adası Testinde Lokomotor Davranışın Yüksek Verimli Analizi, J. Vis. Exp. (2017).
1. Ada Tahlil Kutusu İnşaatı
- Bir su tabakası (yani banyo) içerecek şekilde poli metil metakrilat (PMMA) gibi sağlam bir malzemeden yapılmış bir tepsi hazırlayın. Malzemenin beyaz olmadığından emin olun.
NOT: 40 x 35 x 2,5cm3 boyutlarında olması önerilir (Şekil 1A).
- Sineklerin laboratuvar alanına kaçmasını önlemek için banyonun etrafına yerleştirilmek üzere PMMA gibi sağlam, şeffaf bir malzemeden yapılmış bir kutu (42 x 38 x 25 cm3) hazırlayın. Yan tarafa, deneycinin sineklerle şişeleri kolayca tutması ve adaya bırakması için yeterince büyük bir delik (20 x 30 cm2) yerleştirin (Şekil 1A).
- 10 x 15 x 2,5 cm3 boyutlarında, su geçirmez, geçirimsiz bir malzemeden (PMMA veya plastik) yapılmış yükseltilmiş bir platform hazırlayın.
NOT: Bu platformun, görüntü analizi için iyi bir kontrast sağlamak için tek tip bir beyaz yüzeye sahip olması gerekir. Boyut mutlaka sabit değildir, ancak tüm sineklerin başlangıçta platforma indiğinden ve üzerinde yürüme şansı elde ettiğinden emin olacak kadar büyük olmalıdır (Şekil 1A).
- Deneysel/çekim seansı sırasında platformun konumsal değişikliklerini önlemek için platformu banyoya yapıştırarak veya platform kutusunun içine ağırlık veya diğer ağır nesneler yerleştirerek sabitleyin.
2. Yazılım Gereksinimleri ve Kurulumu
- Görüntü kayıt yazılımının kurulumu.
- Ada görüntü serisini kaydetmek için görüntü kayıt yazılımını indirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve yazılımı bir bilgisayara yükleyin.
NOT: Bu protokolde açıklanan görüntüleme kayıt yazılımı yalnızca Windows tarafından desteklenir. Malzeme Tablosuna diğer kullanıcılar için bir alternatif eklendi.
3. Ada Tahlilinde Test Edilecek Sineklerin Hazırlanması
- Daha önce tarif edildiği gibi (1-2 günlük bir süre boyunca) soğuk veya karbondioksit (CO2) anestezisi altında her deneysel koşul için aşamalı sinekleri toplayın.
- Deney koşulu başına, her biri yaklaşık 15 aşamalı sinek içeren en az 3 numune şişesi hazırlayın. Sadece kanatları bozulmamış ve benzer yaş ve cinsiyete sahip sinekleri kullanın.
NOT: Burada anlatılan deneyler için, w- genotiplerine ait 15 erkek sineği içeren 5 numune şişesi; Aktin-Gal4/+ (kontrol) ve w-; Aktin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) eklosiyon gününde toplandı, 4 gün yaşlandırıldı ve ada testini gerçekleştirmek için kullanıldı. RNAi, kontrol suşları ve Actin-gal4 sürücüsü ticari bir kaynaktan elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Anesteziklerin etkilerinden kaçınmak için sineklerin iyileşmesine izin verin (CO2 kullanırken en az 1 gün), toplanan sinekleri ilgilenilen yaşta ada tahlilinde test etmeden önce.
4. Deney Düzeneği
NOT: Bkz. Şekil 1B.
- Banyo tepsisine az miktarda sabunla soğuk su ekleyin ve platformu ortasına yerleştirin.
NOT: Sabun, suyun yüzey gerilimini azaltır; Suya değen sinekler boğulur. Bu, deney oturumunun ilerlemesi sırasında kutuda uçan sinek miktarının artmasını önler.
- Şeffaf kutuyu tepsinin üzerine yerleştirin ve bir lamba kullanarak platformu yukarıdan aydınlatın.
NOT: Platformun aydınlatılması, esas olarak uygun video kontrastını sağlamak için gereklidir. Bunun için sıradan bir 12 V LED ışık uygundur.
- Web kamerasını doğrudan platformun üzerine (kutunun dışına) yerleştirin ve bir bilgisayara bağlayın.
- Deneylerden önce farklı deney verilerini depolamak için bilgisayarda yeni klasörler oluşturun.
- Klasörleri oluşturmak için Şekil 2 A'da gösterilen örneğin yapısını izleyin. Örneğin, deneysel tasarım, her biri beş kopyalı iki genotipin test edilmesini gerektiriyorsa, önce deneyin tarihini içeren bir ana klasör oluşturun. Ana klasörün içinde iki alt klasör oluşturun (her genotip için bir tane). Genotype klasörlerinin içinde, her replicate.
olmak üzere beş yeni alt klasör oluşturun
NOT: Daha fazla analiz için, bireysel deneylere karşılık gelen görüntü serilerinin benzersiz adlara sahip klasörlere kaydedilmesi önemlidir.
5. Arayüzün "Yakalama Cihazı" bölümünde Video Ayarları Kurulumu
- Görüntü kayıt yazılımını açın ve "Yakala" sekmesi altında "Hızlandırılmış Görüntüler..." seçeneğine tıklayın ve "Yakalama Cihazı" olarak uygun web kamerasını seçin.
- Adaya ölü bir sinek yerleştirin; "Video Ayarları" kutusuna tıklayarak video ayarlarını yapın. Araç çubukları arasında ilerleyin, parlaklığı, kontrastı ve rengi, ölü sinek beyaz bir arka plan üzerinde siyah görünecek şekilde ayarlayın (Şekil 2B). Ayarlamalar tamamlandığında, "Tamam" ı tıklayın.
6. Kayıt ve Video Kaydetme Ayarları Arayüzün "Hızlandırılmış Çekimli" Bölümünde Ayarlayın
- Denemeyi .avi dosyası olarak kaydetmek için "Time-Lapse Movie Setup" (Zaman Atlamalı Film Ayarı) bölümündeki ayarları yapın. "Gözat..."a tıklayın, filmin kaydedileceği dizini seçin, videonun adını tanımlayın ve "kaydet"e basın.
NOT: Video dosyası, verilerin nicelleştirilmesi için kullanılmaz; Ancak, deney hakkında genel bir fikir edinmek faydalı olabilir.
- "Time-Lapse Movie Setup (Zaman Atlamalı Film Ayarı) bölümündeki ayarları yapın.
- Sıkıştırma kutusunda, video sıkıştırma için "Intel IYUV kodu"nu seçin ve "Oynatma hızı (saniyedeki görüntü):" 10 olacak şekilde "Her 0,1 saniyede bir kare çek"i seçin.
- "Gelişmiş..."e tıklayarak deneme zaman serisini .bmp kareler olarak kaydedin...", "Yakalanan her kare için bir .bmp görüntüsü oluştur"u seçin. "Gözat" a tıklayın. "AVI film çekimi sırasında" penceresinde aynı dizini seçin (adım 6.1'de seçildiği gibi), "Aç"a tıklayın ve "Tamam"a basın.
NOT: Deneme sırasında çerçevelerin .bmp dosyaları olarak depolandığına dikkat edin (veri analizi için gereklidir). Program, kareleri "A" ve ardından kare yakalama sırasına karşılık gelen numara (örneğin, "A_number.bmp") olarak adlandırır (Şekil 2C). Daha önce kaydedilmiş görüntü serilerinin üzerine yazılmamasını sağlamak için farklı deneylere ait görüntüleri her zaman yeni bir klasöre kaydedin. "Gelişmiş" kutusu tıklandıktan sonra "Gözat..." altında bu klasör seçilmediği sürece, görüntülerin video dosyasıyla aynı klasöre otomatik olarak kaydedilmediğini unutmayın.
7. Ada Tahlili ve Veri Toplama
- Kaydı başlatmak için görüntü kayıt yazılımının zaman atlamalı görüntü arayüzündeki başlat düğmesine basın.
- Sineklerin şişenin dibinde olduğundan emin olmak için sinek içeren deneysel şişeye (adım 3) 2-3 kez dokunun. Şişenin tapasını hızlı bir şekilde çıkarın ve güçlü bir hareketle, tüm sineklerin aynı anda platforma düşmesi için şişeyi platforma vurun (Şekil 1C).
- Yaklaşık 30 saniye sonra kaydı durdurmak için "Durdur" düğmesine basın.
NOT: Tüm sinekler platformdan kaybolursa, kayıt daha erken durdurulabilir.
- Görüntü kaydını durdurduktan sonra platform üzerinde 30 saniye kalan sinekleri elinizle çıkarın.
- Bir sonraki deneyi kaydetmeye devam etmeden önce, .bmp dosyaları ve filmler için hedef dizini değiştirin (bkz. bölüm 6).
