Bu protokol, Bovier ve ark., Drosophila melanogaster'de Endokrin Bozulmasını Test Etme Yöntemleri, J. Vis. Exp. (2019).
1. Yemek Hazırlama
- Stok bakımı ve larva büyümesi için, %3 toz maya, %10 sakaroz, %9 önceden pişirilmiş mısır unu, %0.4 agar içeren ve daha sonra Mısır unu ortamı (CM) olarak adlandırılan bir mısır unu ortamı kullanın.
- 100 mL musluk suyuna 30 gr maya koyun, kaynatın ve 15 dakika kaynatın.
- Ayrı olarak, 90 g önceden pişirilmiş mısır unu, 100 g şeker ve 4 g agarı 900 mL musluk suyuna iyice karıştırın.
- Çözeltiyi kaynatın, ısıyı düşürün ve sürekli karıştırarak 5 dakika pişirin.
- 5 dakika sonra sıcak maya çözeltisini ekleyin ve 15 dakika daha pişirin.
- Isı kaynağını kapatın ve çözeltinin yaklaşık 60 °C'ye kadar soğumasını bekleyin.
- Etanole 5 mL / L %10 metil 4-hidroksibenzoat ekleyin, iyice karıştırın ve 10 dakika
bekletin.
NOT: Yüksek konsantrasyonda mantar ilacının larvalar için öldürücü olabileceği göz önüne alındığında, metil 4-hidroksibenzoat miktarına dikkat edin.
- Ortamı şişelere / şişelere dağıtın: her sinek şişesine 8 mL (25 mm x 95 mm), her sinek şişesine 3 mL (22 mm x 63 mm) ve her sinek şişesine 60 mL (250 mL).
- Şişeleri tülbentle örtün ve saklamadan önce 24 saat oda sıcaklığında (RT) kurumaya bırakın.
- Kullanılan agar miktarını ve/veya soğutma/kurutma sürelerini değiştirerek CM'nin deneysel olarak doğru kıvamını ve hidrasyonunu kalibre edin.
NOT: fişi çekilmiş, kutulanmış ve sarılmış şişeler 4 °C'de yaklaşık 15 gün stabildir.
- Drosophila yetişkinleri için,% 10 toz maya,% 10 sakaroz,% 2 agar içeren ve daha sonra yetişkin ortamı () olarak adlandırılan bir ortam kullanın.
- 10 g toz maya, 10 g sakaroz, 2 g agar 100 mL damıtılmış suya karıştırın.
- Bu karışımı 3 dakika arayla veya agar eriyene kadar bir mikrodalga kullanarak iki kez kaynatın.
- Çözelti 60 ° C'ye soğuduğunda, etanole 5 mL / L% 10 Metil 4-hidroksibenzoat ekleyin, iyice karıştırın ve şişelere dağıtın (şişe başına 10 mL).
- Şişeleri tülbentle örtün ve saklamadan önce 24 saat RT'de kurumaya bırakın.
NOT: fişi çekilmiş, kutulanmış ve sarılmış şişeler 4 °C'de yaklaşık 15 gün stabildir.
2. Drosophila EDC Dozu
- Seçilen EDC'yi uygun çözücü içinde çözerek uygun bir stok çözeltisi hazırlayın. EE2 (moleküler ağırlık 296.403) için, 0.5 M'lik bir stok çözeltisi yapmak için 1.48 g'ı 10 mL% 100 etanol içinde çözün ve -80 ° C'de saklayın.
Dikkat: EDC'ler çevresel kirletici olarak kabul edilir ve bunların işlenmesinde önlemler alınmalıdır.
- 100 mM'lik bir çözelti elde etmek için EE2 stok çözeltisini su (h/h) içinde %10 etanol içinde seyreltin. CM gıdada sonraki seyreltmeleri (0.1 mM, 0.5 mM ve 1 mM), en düşük konsantrasyondan başlayarak ve her tedavi grubu için aynı nihai çözücü konsantrasyonunu kullanarak yapın. Kontrol şişeleri için tek başına aynı hacimde çözücü kullanın.
NOT: Uçucu yemlerde nihai etanol konsantrasyonunun %2'yi geçmemesi gerektiği göz önünde bulundurularak, çözücünün nihai konsantrasyonunun mümkün olduğunca düşük tutulması önerilir.
- Seçilen EDC'nin doğru seyreltilmesini içeren çözeltiyi katılaşmadan önce mısır unu bazlı gıdaya ekleyin, bir mutfak robotu ile iyice karıştırın, 10 mL'yi şişelere dağıtın, pamuklu gazlı bezle örtün ve kullanmadan önce RT'de 16 saat kurumaya bırakın.
NOT: Bu ortamı hazırlandıktan hemen sonra kullanın.
- Yetişkin yetiştirme için, istenen EE2 konsantrasyonunu (0,1 mM, 0,5 mM ve 1 mM) elde etmek için suda (h/v) %10 etanol içinde ve'nin yüzeyine her birinden 100 μL katman içinde farklı çalışma EE2 çözeltileri (sırasıyla 10 mM, 50 mM ve 100 mM) hazırlayın. Kontrol için tek başına aynı hacimde çözücü kullanın.
NOT: alternatif olarak, seçilen EDC'nin doğru seyreltilmesini içeren çözeltiyi 50 mL'lik konik bir tüpte az miktarda'ye ekleyin, iyice girdaplayın ve 1 mL'sini şişelerinin yüzeyine katmanlayın.
- Şişeleri pamuklu gazlı bezle örtün, hafif çalkalama altında 12-16 saat RT'de kurumaya bırakın ve hemen kullanın.
NOT: Kurutma işlemi ortam nemine bağlı olduğu için deneysel olarak ayarlanmalıdır.
3. Sinek yetiştirme
- Laboratuvarda birkaç nesil tarafından korunan Oregon R gibi sağlam bir izojenik suş kullanın.
- Sinekleri nemlendirilmiş, sıcaklık kontrollü bir inkübatörde, doğal 12 saat ışıkla: 25 ° C'de 12 saat karanlık fotoperiyodu, CM gıda içeren şişelerde saklayın.
- Her tahlilde, RT'de şişeler kullanın.
4. Yaşam Süresi Protokolü
- 8 dişi ve 4 erkek olmak üzere 20 şişe sinek hazırlayın ve 25 ° C'de CM'de (her biri 10 mL) barındırın.
- 4 gün sonra sinekleri atın ve şişeleri tekrar inkübatöre yerleştirin.
NOT: Bu sinekler, sineklerin yaşla senkronize edilmiş diğer kohortlarını elde etmek için yeniden başlamak için kullanılabilir.
- 9. günün öğleden sonrasında, yeni kapatılan tüm sinekleri şişelerden çıkarın ve şişeleri inkübatöre geri koyun.
NOT: birkaç yetişkin, dokuzuncu gün gibi erken bir tarihte kapanmaya başlamalıdır; Bu sineklerin atılması, maksimum sayıda senkronize sinek toplanmasına izin vererek, erken ortaya çıkanların dikkatsiz seçiminden kaçınır.
- 16-24 saat sonra, her iki cinsiyetten yetişkin sinekleri (1 günlük), üç farklı EDC konsantrasyonu ve biri tek başına çözücü ile takviye edilmiş gıdası içeren 250 mL'lik dört şişe grubuna aktarın. Gerekirse, ertesi gün başka bir parti toplayın.
- Sinekleri çiftleşmelerini sağlamak için 2-3 gün boyunca 25 °C'de tutun.
NOT: gıda şişelerine geçiş günü, yetişkinliğin ilk gününe karşılık gelir.
- İki-üç gün sonra, her bir sinek kohortunu hafif CO2 anestezisi altında cinsiyete göre iki gruba ayırın. Her bir cinsiyeti, her tedavi için her cinsiyet için 5 paralel şişeden oluşan üç kopya olana kadar, şişe başına 20 birey yoğunluğunda tedavi başına rastgele beş şişeye bölün.
NOT: CO2'ye uzun süre maruz kalma süresi nedeniyle olası uzun süreli sağlık sorunlarını önlemek için küçük sinek gruplarıyla çalışın.
- Her transferde hayatta kalanların sayısını otomatik olarak elde edecek şekilde, ölü sineklerin sayısının hayatta kalan sineklerin sayısından önceki transfere kadar çıkarıldığı bir yaşam süresi elektronik tablosu hazırlayın.
- Sinekleri her 3 günde bir aynı anda ilgili yiyeceği içeren yeni şişelere aktarın ve ölümü kontrol edin.
NOT: Transfer, sinek ömrü üzerinde uzun vadeli olumsuz bir etkiye sahip olabilecek anestezi olmadan yapılmalıdır.
- Her aktarımda, sineklerin yaşını ve ölü sineklerin sayısını kaydedin.
NOT: Hayatta kalan sineklerin sayısı elektronik tabloda otomatik olarak hesaplanır, ancak görsel olarak kontrol edilmesi önerilir. Aktarım sırasında kazara hem kaçan hem de ölen sinekler dikkate alınmamalıdır. Yeni şişeye taşınan ölü sinekleri iki kez saymamaya dikkat edin, bu notu elektronik tabloda bildirin.
- Tüm sinekler ölene kadar 4.8 ve 4.8.1 adımlarını tekrarlayın.
- Her tedavi grubu için, herhangi bir zamanda bir sineğin hayatta kalma olasılığını göstermek için Şekil 1'de gösterildiği gibi bir hayatta kalma eğrisi oluşturun.
- Her deney için 100 yeni kapatılmış sinek kullanarak, her bir sinek tedavi grubu için üç bağımsız deney gerçekleştirin.
- Ortalama yaşam süresini (her grup için tüm sineklerin ortalama hayatta kalma günleri), yarı ölüm süresini (% 50 ölüm oranına ulaşmak için gereken gün cinsinden süre) ve maksimum yaşam süresini (% 90 ölüm oranına ulaşmak için gereken maksimum gün sayısı) rapor etmek için bir tablo hazırlayın.
- Kontrol grubuna göre her tedavi grubu arasındaki yüzde farklarını hesaplayın.
- Farklı tedavi gruplarını karşılaştırmak için istatistiksel analiz yapın.
