$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Castells-Nobau ve diğerleri, Drosophila Neuromuscular Junction Morphology'nin Yüksek Verimli ve Çok Parametrik Nicelemesi için İki Algoritma, J. Vis. Exp. (2017).
1. Görüntü İşleme Öncesi Gereksinimler
- Daha önce tarif edildiği gibi, üçüncü instar dolaşan larvaların (L3) Drosophila açık kitap hazırlıklarını gerçekleştirin.
- İki markörün bir kombinasyonunu kullanarak Drosophila NMJ terminallerini birlikte immünolabelize edin: "Drosophila NMJ Morphometrics" ile analiz için Brp ile birlikte Dlg-1 veya Hrp ve "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" ile analiz için Brp ile birlikte Syt veya Csp.
NOT: Aynı türden antikorlar, Zenon Alexa Etiketleme Kitleri gibi bir antikor konjugasyon kiti ile önceden etiketlenerek birleştirilebilir.
- Tercih edilen bir mikroskop kullanarak NMJ terminallerini görüntüleyin, örneğin floresan (ApoTome ile veya ApoTome olmadan) veya konfokal mikroskopi.
- NMJ terminalinin 2 kanallı bir görüntü yığınını edinin.
- Mikroskop ayarlarını, kanal 1, Dlg-1 (veya Hrp, Syt, Csp) ile immün etiketli NMJ terminalini ve kanal 2, Brp ile immün olarak işaretlenmiş NMJ terminalini alacak şekilde ayarlayın.
- İsteğe bağlı olarak, makrolarla tek kanallı görüntüleri (tek bir antikorla immün olarak işaretlenmiş sinapsların) analiz edin. "Drosophila NMJ Morphometrics" ile analiz için Dlg-1 veya Hrp ile benzersiz bir şekilde immüno-etiketlenmiş NMJ'ler veya "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" için Syt veya Csp ile benzersiz bir şekilde NMJ'leri görüntüleyin.
NOT: Sadece anti-BRP ile bağışıklığı boyanmış sinapsları analiz etmek mümkün değildir.
- Elde edilen görüntüleri ayrı ayrı .tiff dosyaları olarak dışa aktarın. Belirtildiği gibi alınmadıysa, makroları çalıştırmadan önce kanal sırasını ters çevirin.
2. Yazılım Gereksinimleri ve Kurulumu
- Aşağıdaki web sitesinden "Drosophila NMJ Morphometrics" ve "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" makrolarını indirin: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
- İmleci klasöre getirin "Makrolar güncelleme 1" ve görünen "görünüm" seçeneğine tıklayın. Bu klasörün içeriğini içeren bir liste görünecektir. Klasör, "Drosophila NMJ Morphometrics" ve "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" makrolarını içerir.
NOT: Her iki makro da aynı klasörde sağlanan Fiji 1.4 sürümleriyle uyumludur. Makrolar son sürümlerde çalışmayabilir. Lütfen sağlanan sürüm 1.4'ü kullanın. Daha yeni bir Fiji sürümü bulunan bilgisayarlarda bile bu sürümü başlatmak sorunsuzdur.
- "Tümünü indir" üzerine tıklayın. Klasör içeriği bilgisayara .zip dosyası olarak indirilecektir. İndirilen dosyayı açın.
- Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm ve Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm dosyalarını Fiji.app/plugins/ dizine kopyalayın. Programı yeniden başlatırken, makrolar Eklentiler açılır menüsünün altında görünecektir.
3. NMJ Görüntülerinin Z-projeksiyonlarını ve Hiper Yığınlarını Oluşturmak için Alt makroyu "Yığına Dönüştür"ü çalıştırın
- Araç çubuğunda Eklentiler'i seçerek grafik arayüzü başlatın ve açılır menüden "Drosophila NMJ Morphometrics" öğesini seçin.
- Makronun grafik arayüzünde "Benzersiz Dosya Dizesi" ayarını tanımlayın.
NOT: Mikroskop yazılımı, yığınları ayrı '.tiff dosyaları olarak saklarken düzlemleri ve kanalları düzenlemek için bir tanımlama imzası kullanır. Girilen benzersiz dosya dizisi ayarının, yazılım tarafından ilk kanalın ilk düzlemine atanan imzayı belirtmesi gerekir (önemli: en düşük düzlem ve kanal numarasının belirtilmesi gerekir).
- Yalnızca "Yığına dönüştür" alt makrosunu seçin ve "tamam" ı tıklayın ve görüntülerin bulunduğu klasörü seçin. Birkaç alt klasörü olan bir ana dizin seçilirse, ana dizin ve benzersiz dosya dizesi kriterleriyle eşleşen alt klasör içindeki tüm tek tek '.tiff dosyaları işlenecektir.
- Z yığını yalnızca bir kanal içeriyorsa, "Yalnızca Kanal 1" kutusunu seçin.
- NMJ görüntüsü başına varsayılan olarak stack_image_name ve flatstack_image_name olarak adlandırılan iki yeni dosyanın görüneceğine dikkat edin. Daha fazla analiz için yalnızca bu yığını ve düz yığını saklayın. .tiff dosya serisi bu noktada silinebilir, bu da gerekli depolama kapasitelerini en aza indirir ve olası hata kaynaklarından kaçınır.
4. İlgilenilen NMJ Terminalini Tanımlamak için "ROI'yi Tanımla" Alt makrosunu çalıştırın
- "Drosophila NMJ Morphometrics" grafik arayüzünü başlatın.
- Yalnızca "ROI'yi Tanımla" onay kutusunu seçin ve "Tamam"a basın ve flatstack_name başlıklı görüntülerin saklandığı ana dizini seçin ve "Seç"e basın. "ROI'yi Tanımla" alt makrosu, seçilen ana dizindeki tüm alt klasörlerde otomatik olarak arama yapar.
- İlk projeksiyon açıldığında, araç çubuğundaki "Freehand seçimleri" aracını seçin.
- Fareyi kullanarak, yalnızca ilgilenilen NMJ terminalinin tamamını içeren bir seçim yapın ve pencerede "Tamam" ı tıklayın. Makro bir sonraki projeksiyonla devam edecektir.
- Bir sonraki ROI'yi tanımlayın ve tüm ROI'ler tanımlanana kadar tekrarlayın. "roi_image_name" olarak adlandırılan ROI görüntü dosyası, işlenen görüntülerin her biri için önceden oluşturulan yığın ve projeksiyon görüntüleriyle aynı dizinde saklanacaktır. Bu alt makronun çıktısı, ROI'nin siyah bir arka plan üzerinde beyaz olarak ikili bir görüntüsüdür.
5. NMJ Terminal Özelliklerini Ölçmek için Alt Makro "Analiz"i Çalıştırın
- Araç çubuğuna gidin, "Eklentiler"i seçin ve şunu kullanın:
Anti-Dlg-1 veya anti-HRP (kanal 1) ile anti-Brp (kanal 2) ile birlikte immüno-etiketlenmiş sinapsları analiz ederken "Drosophila_NMJ_Morphometrics" veya anti-Syt veya anti-Csp (kanal 1) ile immün olarak işaretlenmiş sinapsları analiz ederken "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" Brp (kanal 2) ile birlikte.
- Tek kanallı görüntü yığınları analiz edilecekse ("Drosophila_NMJ_Morphometrics" için yapısal kanal Dlg-1 veya HRP veya "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics" için Syt veya Csp), "Yalnızca Kanal 1" kutusunu seçin.
- Analiz edilecek görüntülere karşılık gelen ölçeği ayarlayın.
- Görüntüdeki bir piksel 2,5 μm'ye karşılık geliyorsa, Ölçek-Piksel = 1, Ölçek-Mesafe'yi μm = 2,5 olarak belirtin. Her iki ayarın da 0'da bırakılması durumunda, NMJ alanı, çevre, uzunluk ve en uzun dal uzunluğu piksel sayısı olarak ifade edilecektir.
- Gerekirse, makronun varsayılan analiz ayarlarını yapın. Ayarlamaları yalnızca "Analiz" alt makrosu daha önce tatmin edici olmayan sonuçlarla çalıştırılmışsa gerçekleştirin (ayarların nasıl optimize edileceğine dair talimatlar için bu bölümün sonuna ve bölüm 6'ya bakın).
- "Analiz Et" ve "Bekle" kutularını seçin ve "Tamam" a basın.
- 2 kanallı görüntülerde "Analiz Et" alt makrosunu çalıştırırken "Bekle" onay kutusunu seçin. Aksi takdirde, sınırlı bilgisayar kapasiteleri nedeniyle etkin bölge sayımında hatalar oluşabilir.
- Yeni bir "Dizin Seç" penceresi açılırken, görüntülerin bulunduğu dizini seçin ve "seç" e basın. Makro, ana dizinde ve varsa sonraki klasörlerde depolanan tüm görüntüleri analiz edecektir (önceki alt makroları yürütürken üç dosyayı kullanarak: stack_image_name, flatstack_image_name ve roi_image_name). Makro, her görüntüyü ayrı ayrı ve ardışık olarak işler. Bu işlem, görüntü yığını başına birkaç dakika sürebilir (bilgisayar kapasitesine bağlı olarak).
- Makroyu çalıştırdıktan sonra, depolanan analiz edilen her sinaps için res_image_name adlı yeni bir görüntü dosyasının üst klasörde oluşturulacağını unutmayın. Kantitatif ölçümler "results.txt" dosyası olarak saklanacaktır.
- Segmentasyon hataları olan resimleri tespit etmek ve hariç tutmak için tüm sonuç resimlerini inceleyin. Olası segmentasyon hataları, bu hataların üstesinden gelmek için ayarların nasıl yapılacağına ilişkin tavsiyelerle birlikte Tablo 1'de açıklanmıştır. Bu tür segmentasyon hatalarına sahip sonuç görüntüleri, Şekil 1.
NOT: Makroyu kullanıcı arabiriminde gözlemlenen varsayılan ayarlarla çalıştırırken, makro değerlendirmesi el ile değerlendirmeyle karşılaştırıldığında yaklaşık %95'lik bir doğruluk vardı.
6. Görüntülere makro ayarlarını yapın
- Görüntülerin %5'inden fazlası segmentasyon hataları gösterdiğinde, görüntüler için en uygun makro ayarlarını tanımlamak/seçmek için farklı algoritmaları keşfedin.
- Yuvarlanan top yarıçapı değerini ayarlayın
NOT: Yuvarlanan top yarıçapı işlevi, görüntünün arka planını çıkarır. Bu işlev, floresan mikroskoplarda elde edilen görüntülerle çalışırken ve/veya görüntülerde yüksek arka plan gürültüsü olduğunda çok önemlidir. Arka planın çıkarılması, makronun otomatik eşikleme adımlarının NMJ terminallerinin yeterli segmentasyonunu oluşturmasına yardımcı olacaktır.
- "Yığına dönüştür" alt makrosu tarafından oluşturulan üç NMJ stack_image_name görüntüsü seçin. Görüntü veri kümesini temsil eden görüntüleri seçin.
- Araç çubuğunda Görüntü | Renk | Kanalları ayırın. Biri sırasıyla kanal 1'i ve diğeri kanal 2'yi temsil eden iki görüntü yığını oluşturulacak ve bunları kaydedecektir.
- Dlg-1, Hrp, Syt veya Csp immün etiketlemeye karşılık gelen kanal 1'e ait görüntü yığınını açın.
- Araç çubuğunda "İşlem"i ve ardından açılır menüden "Arka Planı Çıkar..." seçeneğini seçerek "Arka planı çıkar" filtresini çalıştırın.
- Açılır penceredeki önizleme onay kutusuna tıklayın ve yuvarlanan top yarıçapını görüntüler için en uygun değere ayarlayın. "Yuvarlanan top yarıçapı" ayarı, sinaps ve arka plan arasındaki kontrastı artıran değerlere ayarlanmalıdır (bkz. Şekil 2A').
- Örnek için Şekil 2'ye bakın. Panel A'da, sinapsın parçaları arka planla aynı gri seviyeleri gösterirken, Şekil 2 panel A'da 500'lük bir "Yuvarlanan top yarıçapı", sinaps ile arka plan arasında güçlü bir kontrasta neden olur.
- Araç çubuğunda seçerek bir z-projeksiyonu oluşturun Görüntü | Yığın| Z-projeksiyon, Projeksiyon türü = Maksimum Yoğunluk'u seçin ve elde edilen görüntüyü kaydedin. Yuvarlanan top yarıçapı için uygun değer tanımlandığında, aynı yuvarlanan top yarıçapı değerine sahip kalan temsili görüntüler üzerinde "Arka planı çıkar" algoritmasını çalıştırın. Z-projeksiyonlarını oluşturun ve kaydedin (herhangi bir dizine).
NOT: 8 bit veya RGB görüntüler için yuvarlanan top yarıçapı değeri, en az görüntüde arka planın parçası olmayan en büyük nesnenin yarıçapı kadar büyük olmalıdır. 16 bit ve 32 bit görüntüler için yarıçap, piksel değer aralığıyla ters orantılı olmalıdır.
- Kullanılacak farklı otomatik eşikleri belirleyin
- Önceki adımda (6.2.6) kaydedilen Z projeksiyonlarını açın ve Görüntü | Ayarla | Otomatik Eşik | Tümünü deneyin.
- İkili eşikli bir sonuç görüntüsü tüm farklı otomatik eşik algoritmalarıyla birlikte görüneceğinden, görüntüler için en uygun algoritmayı belirleyin.
- Makroyu daha sonra çalıştırırken, makro ayarlarındaki eşiği buna göre değiştirin.
- NMJ anahat eşiği olarak "RenyiEntrophy" veya "Moments" gibi daha kısıtlayıcı eşikler ve NMJ iskeletini belirlemek için "Li" ve aktif bölgeleri belirlemek için "Huang" gibi daha izin verilen eşikler kullanın. Görüntüler çok keskin ve arka plan çok az olduğunda veya hiç olmadığında, "NMJ anahat eşiği" olarak "Huang" kullanın. Aksi takdirde, görüntü segmentasyonundan sonra sinapsın bazı kısımları eksik olabilir.
- Örnek için Şekil 2B'ye bakın. Sinapsın uygun segmentasyonu, yeşil kutularla vurgulanan otomatik eşiklerle elde edilir. Uygun olmayan eşiklerin bazı örnekleri kırmızı kutularla vurgulanmıştır (yüksek büyütmede sinapsları kontrol edin). İkincisinde, sinapsın bazı kısımları eksiktir veya arka planın bazı kısımları dahil edilmiştir.
- Küçük parçacıkların maksimum boyutunu belirleyin
NOT: Bu fonksiyon, NMJ anahat eşiği ve İskelet eşiği tarafından algılanan ve "küçük parçacık ayarında" tanımlanan değerden daha küçük olan tüm parçacıkları analizden hariç tutacaktır. Bu değer piksel cinsinden tanımlanır. Bu işlev bir gürültü filtresi görevi görür ve elde edilen görüntülerde yüksek oranlarda tekdüze olmayan arka plan (kristaller/toz gibi) bulunduğunda çok kullanışlıdır.
- Adım 6.2.6'da kaydedilen Z projeksiyonlarını açın ve ölçeği Analiz | Ölçeği ayarlayın. Aşağıdaki ayarları uygulayın: piksel cinsinden mesafe = 1, bilinen mesafe = 1, piksel en boy oranı = 1, Uzunluk birimi = piksel ve "Tamam"a basın. Araç çubuğundaki "Oval seçim" aracına tıklayın.
- Fareyi kullanarak, immün boyamada bulunan ancak NMJ'ye ait olmayan tek parçacıkları yakından çevreleyen bir seçim çizin. Windows kullanıcıları için Ctrl+m veya Mac kullanıcıları için cmd+m tuşlarına basın. Piksel sayısı olarak seçilen parçacıkların alanını gösteren bir sonuç penceresi açılacaktır.
- En büyük kirletici parçacık/artefakt alanını belirlemek için görüntülerde bulunan birkaç artefakt ile önceki adımı birkaç kez tekrarlayın. Bu, makroyu daha sonra çalıştırırken ayarda ayarlanacak değer olacaktır. Makroyu çalıştırırken, "Küçük Parçacık Boyutu"nu gözlemlenen en küçük parçacık boyutu olarak ayarlayın, bu da %25'lik bir marjdır.
- Örnek için Şekil 2D'ye bakın. Tespit edilen en büyük kristal 112 piksellik bir alana sahip. Bu görüntüyü makro ile işlerken "Küçük parçacık boyutu" ayarı 125 - 150 olarak ayarlanmalıdır.
- Minimum bouton boyutunu belirleyin
NOT: Bu işlev, NMJ anahat eşiği tarafından algılanan ve tanımlanan değerden daha küçük olan tüm butonları analizden hariç tutacaktır. Bu değer piksel cinsinden tanımlanır.
- Bölüm 6.4'te açıklanan adımların aynısını izleyin, ancak bu durumda NMJ terminalinde bulunan en küçük butonları çevreleyen bir seçim yapın. Ölçülenlerin en küçük boutonuna karşılık gelen en küçük alanı seçin. Bu, makroyu daha sonra çalıştırırken minimum bouton boyutu ayarında ayarlanacak değerdir.
- "Maksimum gürültü toleransı" değerini tanımlayın
- Makro için "Maksimum gürültü toleransını bul" değerini tanımlamak için, bölüm 2'de kaydedilen kanal 6.2.2 Z yığınını açın.
- Açılır menüdeki eklentiler sekmesine gidin, İşlem | Maksimum(3D) seçeneğini belirleyin ve maximum_image_name göründüğünde (birkaç dakika sürebilir), orijinal görüntü yığınını kapatın.
- Maximum..._image_name (yeni elde edilen görüntü yığını) seçin ve Eklentiler | Süreç | Minimum (3D), yeni görüntü Minimum Maximum..._image_name Maksimum... _image_name yığınını kapattığında.
- Araç çubuğunda İşlem | Maksimumları bul.... Yeni bir "Maksimumu bul..." penceresi açılacaktır. "Önizleme noktası seçimi..." onay kutusunu tıklayın ve "Gürültü toleransı" kutusunu varsayılan makro ayarı 50 ile doldurun. Maksimum noktalar resimde küçük çarpı işaretleri olarak gösterilecektir.
- Açıklamalı aktif bölgelerin fazlalığını, yani seçilen yığın düzleminde odakta olmayan aktif bölgelerin üstünde olmayan çarpıları veya arka planda algılanan yanlış aktif bölgeleri gözlemliyorsanız "Gürültü toleransı" değerini artırın.
- Öte yandan, eksik açıklamalı aktif bölgeler gözlemleniyorsa, yani odaktaki aktif bölgeler tanınmıyorsa, "Maksimum gürültü toleransı" değerini azaltın. Haçlar odaktaki aktif bölgeleri uygun şekilde etiketleyene kadar bu prosedürü izleyerek farklı değerler denemeye devam edin. "Maksimum gürültü toleransını bul" u bu değerle doldurun.
- Örnek için Şekil 2C'ye bakın. Çok fazla aktif bölge algılandı. Şekil 2C'de, "Maksimum gürültü toleransı" değeri artırılırken yalnızca odaktaki aktif bölgeler algılanır.
- Adım 5.1'de seçilen temsili görüntüler için "Analiz Et" alt makrosunu, önceki tüm adımlarda tanımlanan ayarlarla çalıştırın.
- Brp-puncta alt ve üst eşiği ayarlayın
- Makroyu 2_active_zone_stack_image_name adı verilen adım 6.6'ya göre çalıştırdıktan sonra yeni bir dosyanın görüneceğine dikkat edin. Bu görüntü yığınında, "Maksimum bul" fonksiyonu tarafından algılanan aktif bölgeler, her düzlemde beyaz noktalarla gösterilir.
- Bu dosyayı araç çubuğuna sürükleyip bırakarak açın ve Görüntü | Yığın | Z-projesi | Projeksiyon türü = Dilimleri topla. 2_active_zone_stack_image_name bir projeksiyonu elde edilecektir.
- Resim Seç | Ayarla | Eşik. Yeni bir "Eşik" penceresi açılacaktır. İstenen tüm odaklar/Brp-pozitif noktaların kırmızı renkte görüntülendiği bir eşik değeri seçmek için üst çubuğu kaydırın.
NOT: Eşik çok düşük ayarlanırsa, fazla aktif bölge sayılacaktır. Çok yükseğe ayarlanırsa, aktif bölgelerin bir kısmı kaçırılır.
- Bir örnek için Şekil 2E'ye bakın. Eşik 400 olarak ayarlandığında, aktif bölgelerin çoğu (1 piksellik odaklar olarak sembolize edilir) kırmızı renkle vurgulanmadıkları için segmentasyona dahil edilmez (Şekil 2E). Eşik 50 değerine ayarlandığında, tüm aktif bölgeler kırmızı renkle vurgulanır (Şekil 2E').
- Bu değeri minimum eşik olarak tanımlayın. "Üst puncta eşiğini" maksimum değerde bırakın.
- Temsili görüntüler için "Analiz Et" alt makrosunu, bu bölümün önceki tüm adımlarında tanımlanan ayarlarla yeniden çalıştırın. Ortaya çıkan görüntü dosyalarını eleştirel olarak değerlendirin ve segmentasyonun düzgün bir şekilde yapıldığından emin olun. Aksi takdirde, segmentasyon hatalarının doğasına göre ayarları yeniden ayarlayın (Şekil 1, Tablo 1).
