Bu protokol, Li ve ark., Periferik ve Merkezi Sinir Sisteminde Nörorejenerasyonu İncelemek için Bir Drosophila In Vivo Yaralanma Modeli, J. Vis. Exp. (2018).
1. İki Foton Yaralanması ve Konfokal Görüntüleme
- Mikroskop kurulumu
NOT: Bu deney için iki fotonlu lazerli bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanıldı, ancak eşdeğer bir kuruluma sahip diğer sistemler de yeterli olacaktır. GFP'nin yaralanma sağlamak için iki fotonlu lazer (930 nm) ve konfokal görüntüleme için bir Argon lazer (488 nm) kullanıldı.
- Her seansın başında, iki fotonlu lazeri ve / veya konfokal lazerleri ve mikroskobu açın. Görüntüleme yazılımını açın.
- İki foton yaralanması için, 930 nm'de (1.950 mW) iki fotonlu lazerle GFP'yi görüntülemek için aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
- Çizgi tarama modunu seçin. İğne deliğini sonuna kadar açın. Lazer yoğunluğunu ~%20'ye (390 mW) yükseltin.
- Kare taraması olarak 512 x 512'yi seçin. Maksimum tarama hızını kullanın (tipik olarak piksel bekleme süresi 0,77 μs'deyken). Ortalama sayının 1 ve bit derinliğinin 8 bit olduğundan emin olun.
- Kazancı ~750 ve uzaklığı 0 olarak ayarlayın.
- Bu önceden ayarlanmış deneysel protokolü 2P GFP 930 Ablasyon olarak kaydedin ve gelecekteki deneylerde kolay yeniden kullanıma izin verin.
- Konfokal görüntüleme için, GFP'yi Argon lazer ile 488 nm'de görüntülemek için aşağıdaki parametreleri ayarlayın:
- Edinme sekmesini ve ardından Z-stack'i seçin.
- "Lazer" altında, 488 nm Argon lazerin gücünü açın.
- Kanallar'a gidin, 488 mm lazeri seçin ve lazer gücünü %5-10'a yükseltin. İğne deliği için 1-2 havadar üniteyi (AU) kullanın. Kazancı 650'ye ayarlayın.
- Alma Modunda, kare taraması olarak 1024 x 1024'ü seçin, maksimum tarama hızını, ortalama 2 sayısını ve 8 Bit bit derinliğini kullanın.
- Bu önceden ayarlanmış deneysel protokolü GFP Görüntüleme olarak kaydedin.
- Dietil eter ile larva anestezisi ve montajı
- Çeker ocakta, 15 cm'lik plastik bir Petri kabına 60 mm'lik bir cam tabak yerleştirin. Cam tabağın dibine bir parça kağıt mendil katlayın ve yerleştirin, ardından mendilin üzerine bir üzüm suyu agar tabağı yerleştirin. Cam tabağa, kağıt mendilin ıslandığı ve tabakta bir sıvı eter tabakası kaldığı noktaya kadar dietil eter ekleyin. Kapağı her zaman açık tutun.
- Ortasında bir damla halokarbon 27 yağı bulunan bir cam slayt hazırlayın. Daha sonra lamel desteklemek için sürgünün dört köşesine 4 nokta vakumlu gres ekleyin.
- Temizlenmiş bir larvayı almak için forseps kullanın ve 60 mm'lik cam tabaktaki agar plakasına yerleştirin. Cam tabağı kapağıyla örtün ve larva hareket etmeyi bırakana kadar bekleyin. PNS yaralanması/görüntülemesi için, kuyruğu seğirmeyi bırakır bırakmaz larvayı çıkarın. CNS için, tüm larva, özellikle baş segmentleri hareketsiz hale gelene kadar bekleyin.
NOT: Eter maruziyetinin zamanlaması kritiktir. Tartışmaya bakın.
- Anestezi uygulanmış larvaları dikkatlice alın ve slayttaki halokarbon yağı damlasına baş dik olarak yerleştirin. Slaytın üstüne bir lamel ekleyin. Lameli larvaya değene kadar aşağı doğru itmek için hafif bir baskı uygulayın (Şekil 1A).
- Larvaları yuvarlamak için lameli hafifçe sola veya sağa doğru iterek larvanın konumunu ayarlayın, böylece ilgilenilen nöron/akson/dendrit üstte ve mikroskop merceğine en yakın olacaktır.
- PNS yaralanması için, her iki trakea da görünecek şekilde larva sırt tarafını yukarı monte edin. Daha sonra larvaları sınıf III da nöron aksonlarını yaralamak için ~30 derece sola (Şekil 1B ve 1C), sınıf IV da nöron aksonlarını yaralamak için 90 derece (Şekil 1B ve 1E) veya sınıf IV da nöron dendritlerini yaralamak için ~30 derece (Şekil 2 A) yuvarlayın.
- CNS yaralanması için, larvayı mükemmel bir şekilde ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 3A), böylece ilgilenilen bölge z-düzlemindeki mikroskop merceğine en yakın olacaktır.
- İki fotonlu lazerle yaralanma
- Larva ile slaytı mikroskop altına yerleştirin ve sahne üzerindeki slayt tutucu ile yerine sabitleyin. Larvayı bulmak için 10X (0.3 NA) hedefini kullanın.
- Lamel üzerine 1 damla objektif yağı ekleyin, 40X (1.3 NA) objektife geçin ve odağı ayarlayın.
- Tarama moduna geçin ve deneysel protokol 2P GFP 930 Ablasyon'u yeniden kullanın. İğne deliğinin tamamen açık olduğundan emin olun.
NOT: Konfigürasyonun bireysel sistemlere göre optimize edilmesi gerekir.
- İlgilenilen bölgeyi (ROI) bulmak için Canlı modu başlatın ve uygun zoom.
ile iyi görüntü kalitesi elde etmek için ayarlarda ince ayar yapın
NOT: Bu adımın amacı, en kaliteli görüntüyü almaktan ziyade, yaralanacak nöron/akson/dendriti bulmaktır. Bu nedenle, aşırı pozlama veya foto ağartmayı önlemek için hedef alanı görselleştirmek için yeterli minimum ayarları kullanın.
- Kırp düğmesinin kullanılabilir hale gelmesi için Canlı taramayı durdurun. Hareketsiz görüntünün yol haritası olarak hizmet etmesine izin verin. Kırpma işlevini seçin ve yaralanacak hedefe odaklanmak için tarama penceresini ayarlayın.
- Yatırım getirisini, olası yaralanma bölgesinin boyutu olacak şekilde azaltın. Örneğin, yaralanmanın hassasiyetini sağlamak ve komşu dokulara verilen zararı azaltmak için bir akson veya dendritin genişliğini kaplayın. İstenirse, kırpmadan önce yatırım getirisini yakınlaştırarak daha hassas yaralanmaya izin verin.
- Yeni bir görüntüleme penceresi açın. Tarama hızını azaltın ve lazer yoğunluğunu artırın. Canlı modda taranan doku floresan sinyaline dayalı olarak lazer yoğunluğundaki artışı belirleyin.
- Tipik olarak, PNS yaralanması için% 25'ten ve VNC yaralanması için% 50-100'den başlayarak iki fotonlu lazer yoğunluğunu ayarlayın. PNS akson yaralanması için lazer yoğunluğunun ~480 mW ve piksel bekleme süresinin 8,19 μs olduğundan emin olun. VNC akson yaralanması için, lazer yoğunluğunun ve piksel bekleme süresinin sırasıyla 965-1930 mW ve 8.19-32.77 μs olduğundan emin olun.
- Sürekli taramayı başlatın. İmleci Sürekli düğmesinin üzerine getirin. Görüntüyü yakından takip edin ve floresanda ciddi bir artış gözlenir gözlenmez taramayı durdurun.
NOT: Floresan sivri ucunun görünümü, yaralanma bölgesindeki otomatik floresanstan kaynaklanmaktadır.
- Ayarları yeniden kullanarak Canlı moda geri dönün. Odağı ayarlayarak az önce hedeflenen ilgi alanını bulun.
NOT: Başarılı bir yaralanmanın iyi bir göstergesi, yaralanma bölgesinde küçük bir kraterin, halka benzeri yapının veya lokalize döküntülerin ortaya çıkmasıdır.
- Bir sonraki nörona geçin ve tek bir hayvanda birden fazla nöronu yaralamak için Adım 1.3.5'ten itibaren tekrarlayın. Veya ilk yaralanma yetersizse, gücü kademeli olarak artırırken ve/veya tarama hızını azaltırken Adım 1.3.5'i tekrarlayın.
NOT: Lazer gücünün çok yüksek olması durumunda, yaralanma sonrası canlı tarama görüntüsünde büyük bir hasarlı alan görünecektir. Çok fazla yaralanma larvaların ölümüne neden olabilir.
- Lameli dikkatlice çıkararak ve yaralı larvaları maya ezmesi ile yeni bir tabağa aktararak larvaları kurtarın. Forseps ile agar plakası üzerinde birkaç mağara hendek açın; Alternatif olarak, larvaların plakadan dışarı çıkma olasılığını azaltmak için tüm plakayı kullanmak yerine plakada bir agar adası yapın.
- Plakayı ıslak dokulu (% 0,5 propiyonik asit çözeltisi ile ıslatılmış) 60 mm'lik bir Petri kabına koyun ve oda sıcaklığında veya 25 ° C.
NOT: Larva, 25 °C'ye kıyasla oda sıcaklığında (22 °C) yaklaşık bir gün daha larva aşamasında kalacaktır.
- Yaralanma sonrası konfokal görüntüleme
- Adım 1.2'deki gibi aynı anestezi ve montaj prosedürünü kullanarak larvayı hazırlayarak yaralı larvayı istenen zaman noktalarında görüntüleyin, ardından konfokal lazerle görüntüleyin.
NOT: Aksonal yaralanmayı doğrulamak için yaralanmadan 24 saat sonra (AI) ve rejenerasyonu değerlendirmek için 48 saat AI (sınıf IV da nöronlar) veya 72 saat AI'de (sınıf III da nöronlar) larvaları görüntüleyin.
- 10X hedefini kullanarak larvayı bulun, ardından 25X (0.8 NA) hedefine geçin. Deneysel protokol GFP Imaging'i yeniden kullanın.
- Canlı düğmesine tıklayın ve daha önce yaralanmış aynı nöronu bulun.
- Canlı tarama penceresinde ilk ve son Z konumlarını ayarlayın. Durdur'a basın ve bir Z yığını görüntüsü almak için Denemeyi başlat'a tıklayın.
NOT: Rejenerasyonun nicelleştirilmesinin mümkün olması için görüntüleri yakalarken bir normalizasyon noktasının (akson yakınsama noktası) dahil edildiğinden emin olun (Şekil 1D, 1F) – bu, veri analizi bölümünde daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.
- Görüntü İşleme'ye geçin, az önce çekilen görüntüyü seçin ve maksimum yoğunlukta bir projeksiyon oluşturun. Hem z-stack hem de maksimum yoğunluk projeksiyon görüntülerini kaydedin.
