$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol Catrina ve ark., Canlı Drosophila melanogaster Yumurta Odalarında Endojen mRNA'ları Görselleştirme ve İzleme, J. Vis. Exp. (2019).
1. Canlı Hücre Görüntüleme için MB'lerin Tasarımı
- mfold sunucusundan gelen "RNA formunu" (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form) kullanarak mRNA hedefinin ikincil yapısını tahmin etmek için hedef RNA dizisini katlayın.
- Hedef diziyi FASTA formatında yapıştırın/yükleyin, %5 veya %10 alt optimallik seçin (sırasıyla MFE değerinin %5 veya %10'u içinde serbest katlanma enerjisine sahip yapılar) ve hesaplanan maksimum katlama sayısını buna göre ayarlayın (örn. %10 alt optimallik için daha büyük).
NOT: MB'ler tasarlanırken optimal olmayan ikincil yapıların dahil edilmesi, hedef mRNA içinde, tek başına minimum serbest enerji (MFE) yapısı için tahmin edilenden daha esnek veya daha katı olabilen bölgelerin tanımlanmasına izin verir, bu da canlı hücre görüntülemesi için uygun MB'lerin genel tasarımını geliştirir.
- 800 nükleotidlik (nt) mRNA hedefleri için bir "acil iş" veya 801 ile 8.000 nt arasındaki mRNA uzunlukları için bir "toplu iş" seçin. "ss-count" dosyasını basit bir metin dosyası olarak kaydedin.
- mRNA hedefi için birkaç MB tasarlamak için PinMol programı (https://bratulab.wordpress.com/software/) için girdi olarak adım 1.1'de elde edilen "ss-count" dosyasını kullanın (PinMol programının kullanımını açıklayan eğitimlere bakın>https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ ) olarak adlandırılır.
- BLAST analizi yaparak seçilen MB'lerin özgüllüğünü belirleyin: uygun veri tabanıyla "blastn" kullanın (örneğin, oskar mRNA'ya özgü MB'ler için "refseq-rna" veri tabanını ve Drosophila melanogaster organizmasını kullanın).
- mRNA hedefinin herhangi bir dokuya özgü ekspresyonunu tanımlayın (örn. oskar mRNA Flybase> Yüksek Verimli İfade Verileri> FlyAtlas Anatomy Microarray veya modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) ve herhangi bir olumlu BLAST isabetiyle karşılaştırın. İlgilenilen doku/hücrede de ifade edilen diğer mRNA'larla %>50 çapraz homoloji gösteren probları ortadan kaldırın.
- Canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için mevcut mikroskopi kurulumuna uygun florofor ve söndürücü çiftini seçin (örn. Cy5/BHQ2).
2. MB Sentezi, Saflaştırılması ve Karakterizasyonu
- Aşağıdaki etiketleme şemasını kullanarak bir ila beş MB'yi sentezlemek ve saflaştırmak için Bratu, Moleküler Biyoloji Yöntemleri'nde (2006) daha önce açıklandığı gibi kurum içi sentez ve saflaştırmayı veya ticari sağlayıcılardan gelen hizmetleri kullanın (yukarıdaki nota bakın): [5' (Florofor) - (C3 veya C6 bağlayıcı) - (2'-O-metil MB dizisi) - (Söndürücü) 3']. Ters fazlı HPLC kullanarak, şirket içinde veya ticari sağlayıcının hizmetlerini kullanarak MB'leri saflaştırın.
NOT: Otomatik prob sentezi için kullanılan fosforamiditler, 2'-O-metil ribonükleotid modifikasyonuna sahip olmalıdır. Daha kısa bir MB ile hedef mRNA'sı arasındaki bir hibritin stabilitesini artırmak için alternatif kilitli nükleik asit (LNA) ve 2'-O-metil modifikasyonlarının kimeraları da kullanılabilir.
- Hedeflenen RNA bölgesinin dizisiyle eşleşen ve bu nedenle in vitro karakterizasyonda kullanılmak üzere MB'lerin prob bölgesine tamamlayıcı olan DNA oligonükleotidlerini sentezleyin (bkz. adım 2.3 ila 2.5; yukarıdaki not). Hedef mRNA dizisinde bulunduğu gibi, DNA hedefinin her iki ucuna dört ek nükleotid dahil ederek, MB'nin DNA-oligonükleotid hedef taklidi ile hibridizasyonunu en üst düzeye çıkarın.
NOT: Hedeflenen diziyi tespit etmek için MB'nin verimliliğinin daha titiz bir karakterizasyonu, tamamlayıcı DNA oligonükleotidleri yerine in vitro sentezlenmiş RNA hedefleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- Tek başına MB'nin termal denatürasyonunu gerçekleştirin, erime sıcaklığını (Tm) ölçün ve MB'nin fizyolojik sıcaklıkta istenen saç tokası şeklini aldığını onaylayın. 60 ile 90 °C arasında Tm değerleri gözlemledik.
- DNA oligonükleotid hedefinin varlığında MB'nin termal denatürasyonunu gerçekleştirin ve daha önce Bratu, Moleküler Biyolojide Yöntemler (2006) 'da açıklandığı gibi MB: DNA hedef hibritinin Tm'sini ölçün. MB:DNA hibriti için 55 ila 60 °C arasında bir Tm istenir.
- Karşılık gelen DNA oligonükleotid hedefi ile in vitro hibridizasyon reaksiyonları gerçekleştirin ve daha önce Bratu, Moleküler Biyolojide Yöntemler (2006) 'da açıklandığı gibi fizyolojik sıcaklıkta MB: DNA hibrit oluşumunun verimliliğini belirleyin. DNA hedef taklidi ile hızlı hibridizasyon kinetiği arzu edilir, ancak DNA hedefleri ile yüksek hibridizasyon verimliliği göstermeyen MB'ler, in vitro ve/veya in vivo olarak hedef mRNA ile daha iyi bir performansa sahip olabilir.
3. Mikroenjeksiyon için Bireysel Yumurta Odalarının Diseksiyonu ve Hazırlanması
- Yeni yumurtadan çıkmış, çiftleşmiş dişileri 2-3 gün taze maya ezmesi ile besleyin.
- Anestezik bir CO2 pedi üzerinde uçar ve ince cımbız (Dumont # 5) kullanarak, 1-2 dişiyi bir cam kapak kaymasında bir damla Halokarbon yağı 700'e aktarın.
- Bir cımbız kullanarak, sineği stereomikroskop altında sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Arka uçta küçük bir kesi yaparak kadın karnını inceleyin ve yumurtalık çiftini hafifçe yağın içine sıkın.
- Yumurtalıkları yeni bir lamel üzerindeki bir yağ damlasına yerleştirin. Bir cımbızla bir yumurtalığı nazikçe tutarken, diğer cımbızla yumurtalığın en genç aşamalarını sıkıştırın. oskar mRNA, orta oogenezde ve sonrasında (evre > 7) aktif olarak lokalize olur ve daha genç yumurta odalarının (evre < 7) enjekte edilmesi daha zordur ve uzun süre hayatta kalamazlar. Tek tek yumurtalıklar veya yumurta odaları izole edilene ve dikey olarak hizalanana kadar kapak kızağını (aşağı doğru bir hareketle) yavaşça sürükleyin. İstenmeyen aşamaları yumurtalık yumurta zincirinden çıkararak tek yumurta odalarını daha da ayırın.
NOT: Tek tek alay edilen yumurta odalarının yağda yüzmediğinden ve kapak kızağına yapıştığından emin olun. Bu hem başarılı mikroenjeksiyon hem de görüntü elde etmek için önemlidir.
4. Yumurta Odalarının Hemşire Hücrelerine MB'lerin Mikroenjeksiyonu
- Bir moleküler işaret (örneğin osk2216Cy5) veya farklı mRNA'ları hedefleyen ve spektral olarak farklı floroforlarla etiketlenmiş iki MB'nin bir karışımı (örneğin osk2216Cy5 ve drongo1111Cy3) kullanarak MB çözeltisini hazırlayın. HybBuffer'da her MB'de 200-300 ng / μL'lik bir konsantrasyon kullanın (50 mM Tris-HCl - pH 7.5, 1.5 mM MgCl2 ve 100 mM NaCl). HybBuffer'da her biri 200 ng/μL'de aynı mRNA'yı hedefleyen aynı florofor ile etiketlenmiş dört MB'lık bir kokteyl için (örn. osk82, osk1236, osk2216). Mikroenjeksiyon için iğneyi yüklemeden hemen önce MB solüsyonunu aşağı doğru döndürün.
- Reklam verme amacını seçin. Uygun bir yumurta odası bulmak ve mikroenjeksiyon yapmak için 40x yağ hedefi önerilir.
- Lamel disseke yumurta haznesi ile mikroskop tablasına monte edin. Hedefi odak konumuna getirin ve orta-geç gelişim aşamasında, mikroenjeksiyon için uygun şekilde yönlendirilmiş bir yumurta odası belirleyin (yani, oosit proksitiline yakın bir hemşire hücresi içinde kolay enjeksiyona izin vermek için AàP ekseni iğne ucuna dik olacak şekilde).
- ~1 μL MB solüsyonlu bir iğne (ticari veya evde hazırlanmış) yükleyin (bkz. adım 1.1) ve mikroenjektöre bağlayın. D. melanogaster yumurta odalarındaki mikroenjeksiyonlar için, birkaç hemşire hücresinin delinmesini önlemek için iğneyi (Malzeme Tablosuna bakınız) mikroskop aşamasına <45°'lik bir açıyla (örn. 30°) yönlendirin.
- Enjektörü 500-1.000 hPa enjeksiyon basıncı ve 100-250 hPa dengeleme basıncı ile ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Yumurta odalarının boş olduğu bir yağ damlası alanını görüş alanına getirmek için sahneyi yavaşça hareket ettirin.
- Mikromanipülatör joystick'ini kullanarak, iğneyi yavaşça yağ damlasına indirin ve ucunu görüş alanının çevresine doğru odaklayın.
- İğnenin ucundaki havayı çıkarmak ve iğneden akış olduğundan emin olmak için 'temiz' bir işlev gerçekleştirin.
- İğneyi başlangıç konumuna getirin ve mikroenjekte edilecek yumurta haznesine odaklanın, ardından iğneyi tekrar odağa getirin ve yumurta haznesinin kenarına yakın bir yere yerleştirin.
- Objektifin Z pozisyonunda, folikül hücrelerini hemşire hücrelerinden ayıran zar odakta olacak şekilde ince bir ayar yapın.
- İğneyi bir hemşire hücresine yerleştirin ve 2-5 saniye boyunca enjeksiyon yapın.
- İğneyi yavaşça çıkarın ve başlangıç konumuna geri çekin.
- Hedefi görüntü alımı için istenen büyütme oranına (60-63x veya 100x) değiştirin, yumurta odasına odaklanın ve alıma başlayın.