$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Du ve ark., Genom Düzenleme ile Drosophila'da Dokuya Özgü İkili Transkripsiyon Sistemleri Oluşturmak İçin Etkili Bir Strateji, J. Vis. Exp. (2018).
1. Sinek genetiği ve taraması (Şekil 1 ve Şekil 2)
- Enjekte edilen embriyolar yetişkinlere dönüştüğünde, her bir G0 sineğini dengeleyici sineklere çaprazlayın. Hedeflenen aleli içeren kromozom için uygun dengeleyiciyi seçin.
- Her G0 çaprazlamasından F1 yavrularını bir CO2 pedi üzerinde uyuşturun ve stereomikroskop altında rastgele 10-20 erkek seçin. Şekil 2'de gösterildiği gibi dengeleyici dişilere tek tek çaprazlayın.
- F2 larvaları yumurtadan çıktığında, her çaprazlamadan tek F1 babasını seçin ve tek sinek genomik DNA hazırlama protokolünü kullanarak gDNA'yı çıkarın:
- gDNA ekstraksiyon tamponu hazırlayın: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, oda sıcaklığında saklayın. 20 mg / mL Proteinaz K stok çözeltisi hazırlayın ve dondurucuda saklayın.
- Her sineği 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne koyun ve tüpü etiketleyin. Gece boyunca -80 °C dondurucuda saklayın.
- 200 μg/mL nihai konsantrasyonda Proteinaz K.
içeren taze bir çalışma hacmi gDNA ekstraksiyon tamponu hazırlayın
Not: Bu adım için eski bir arabellek kullanmayın.
- Sıvıyı dağıtmadan 50 μL ezme tamponu içeren bir pipet ucuyla her sineği 10-15 saniye boyunca ezin. Kalan tamponu tüpe dağıtın ve iyice karıştırın. 37 °C'de 20-30 dakika inkübe edin.
- Proteinaz K'yi etkisiz hale getirmek için tüpleri 1-2 dakika boyunca 95 °C ısı bloğuna koyun.
- 10.000 x g'da 5 dakika aşağı çevirin. Daha fazla PCR analizi için preparatı 4 °C'de saklayın.
- Negatif kontrol görevi gören bir nos-Cas9 sineğinden gDNA hazırlamak için aynı yöntemi kullanın. Her F1 erkeğinin gDNA'sını şablon olarak kullanarak doğru "uçları" HDR'yi (Şekil 1, Şekil 3) belirlemek için üç adımlı PCR tabanlı ekranlar gerçekleştirin 5. Aşağıdaki PCR reaksiyon sisteminde 1 μL DNA hazırlığı kullanın: 10 μL 2x Boya ile 2x PCR Master Karışımı, her primerden 1 μL (10 μM), 1 μL DNA şablonu ve 7 μL ddH2O.
- Şekil 3 A'da gösterildiği gibi, yerleştirme veya değiştirmenin varlığını taramak için fwd1 ve rev1 primerlerini kullanarak PCR gerçekleştirin; 2' bölgesinden yerleştirme veya değiştirmeyi doğrulamak için fwd2 ve rev3 primerlerini kullanarak PCR gerçekleştirin; "Bitiş" HDR'yi kontrol etmek için M13F ve rev3 primerlerini kullanarak PCR gerçekleştirin (Tablo 1C).
- Onaylanmış bitiş-çıkış HDR ile uçuş çizgilerini koruyun ve F2 neslinden dengeli stoklar oluşturun. Dengeleyiciye çaprazlama, diğer kromozomlardaki istenmeyen mutasyonları gidermek için tekrar uçar.
