$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Koon ve ark., Taramalı Elektron Mikroskobunda (SEM) Morfolojik Analiz için Kimyasal Kurutma Kullanılarak Prokaryotik ve Ökaryotik Organizmaların Hazırlanması, J. Vis. Exp.(2019).
1. Hazırlık ve Fiksasyon
- Drosophila melanogaster (meyve sineği) hazırlayın.
- Yetişkin sinekleri% 100 karbondioksit kullanarak uyuşturun. Anestezi uygulanmış yetişkinleri (yaklaşık 10 ila 30 sinek) küçük bir plastik vidalı kapaklı şişeye veya 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Anestezi uygulanmış sinekleri 4 ° C'de 2 saat (veya gece boyunca) 1 mL fiksatif (% 1.25 glutaraldehit, 0.1 M fosfat tamponu pH 7.2) içine daldırın. Sinekler fiksatifin yüzeyine yüzerse, fiksatifin yüzey gerilimini zayıflatmak için birkaç damla% 2.5 polietilen glikol tert-oktilfenil eter ekleyin ve dokunun tamamen daldırılmasına izin verin. Bir cam pipet kullanarak sabitleyiciyi çıkarın.
2. Yıkama ve Dehidrasyon
- Drosophila melanogaster'i (meyve sineği) yıkayın ve kurutun.
- Sabit numuneyi 1 mL 0.1 M fosfat tampon pH 7.2 ile oda sıcaklığında 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Sinekleri çıkarmamaya dikkat ederek her yıkamayı bir cam pipetle çıkarın.
- Numuneyi, bir mikrofüj tüpünde 1 mL'lik bir hacimde 10 dakika boyunca dereceli bir etanol serisi kullanarak kurutun. Etanol konsantrasyonları: %25, %50, %75, %80, %95, %100. Etanolü bir cam pipetle çıkarın, sinekleri çıkarmamaya dikkat edin.
- Numuneyi, kurutmadan önce numuneyi kaplamaya yetecek kadar %100 etanol ile 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde tutun.
3. Kurutma
- Heksametildisilazan (HMDS) kullanarak kimyasal kurutma yapın.
- %100 etanol çözeltisini 20 dakika boyunca 1:2 HMDS çözeltisi ve %100 etanol ile değiştirin. 1:2 çözeltisini 20 dakika boyunca 2:1 HMDS çözeltisi ve %100 etanol ile değiştirin. 2:1 çözeltisini 20 dakika boyunca %100 HMDS ile değiştirin. Bir kez tekrarlayın.
Not: HMDS yanıcı ve akut bir toksindir (dermal yol). HMDS, eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak kimyasal çeker ocakta kullanılmalıdır.
- Numuneyi HMDS'de, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpündeyse, tek kullanımlık bir alüminyum tartım kabına aktarın. Alüminyum tartım kabına girdikten sonra, %100 HMDS'yi numuneyi kaplayacak kadar taze %100 HMDS ile değiştirin.
- Numuneyi taze kurutucu (5-6 cm derinliğinde) içeren plastik veya cam vakumsuz bir kurutucuya aktarın ve kimyasal bir çeker ocak içine yerleştirin. Alternatif olarak, numunenin üzerine düşmesini önlemek için numuneyi kutu gibi gevşek bir kapakla kuruması için doğrudan bir kimyasal çeker ocak içine yerleştirin. Numunenin 12 ila 24 saat kurumasını bekleyin.
4. Montaj
- Drosophila melanogaster Dağı (meyve sineği).
- Üstüne neyin yerleştirildiğini belirtmek için alüminyum montaj saplamasının altını etiketleyin.
Kurumuş sinekleri, hassas cımbız ile diseksiyon mikroskobu altında bir saplamanın üstüne sabitlenmiş yapışkan veya karbon yapışkan tırnak üzerine istenen konuma yerleştirin.
- Saplamaların dış kenarlarına gümüş iletken yapıştırıcı, yani gümüş boya sürün. İletkenliği sağlamak için gümüş boyayı bir kürdan kullanarak sineklere bağlayın. Boyanın istenen görüntüleme alanına temas etmesine izin vermeyin.
- Saplamaları bir saplama tutucu kutusuna yerleştirin ve açık saplama tutucu kutusunu bir desikatöre yerleştirin. En iyi sonucu elde etmek için gümüş boyanın en az 3 saat veya gece boyunca kurumasını bekleyin.