Bu protokol, Sunderhaus ve Kretzschmar, Drosophila'da Nörodejenerasyonu Ölçmek için Kütle Histolojisi, J. Vis. Exp. (2016).
1. Başın Yakalara Sabitlenmesi ve Parafine Gömülmesi
NOT: Sabitleme işlemindeki tüm adımlar çeker ocakta yapılmalıdır. Metilbenzoat, sağlık riski oluşturmasa da, çeker ocakta kullanılmazsa bunaltıcı olabilen oldukça belirgin bir kokuya sahiptir.
- Sinekleri uyuşturmadan önce, 30 mL %99 etanole 15 mL kloroform ve 5 mL buzlu asetik asit ekleyerek 50 mL Carnoy çözeltisi oluşturun (kloroform ve asetik asidi karıştırmayın). Bileziklerin düz bir şekilde durmasını ve çözelti ile tamamen kaplanmasını sağlamak için kristalleştirici bir kap gibi düz tabanlı bir cam kabın içine dökün.
- Sinekleri CO2 veya eter ile uyuşturun.
- Forseps kullanarak sinekleri boyunlarından yakalara (çoğu yakada 20'ye kadar) geçirin. Şekil 1 A'da görüldüğü gibi tüm başlıkları aynı yönde hizalamayı unutmayın ve başa veya gözlere herhangi bir zarar gelmemesini sağlamak için nazik olun.
- Sinüs oculis sineklerini (oklar, Şekil 1A) rastgele konumlara dahil edin, böylece sineklerin sırası bölümlerde kolayca tanımlanabilir. Ek olarak, deney sinekleri açık veya beyaz bir göz rengine sahipse, slaytı lekelemek için yeterli pigmentin mevcut olduğundan emin olmak için aralarına vahşi tip gibi bazı kırmızı gözlü sinekler geçirin. Birden fazla yaka kullanılıyorsa, sineklerin sırasını yaka numarası ile birlikte bir protokol sayfasına kaydedin.
- Bir yaka bittiğinde, 3,5 - 4 saat boyunca hazırlanan Carnoy çözeltisine yerleştirin.
- Carnoy çözeltisini uygun atık kabına boşaltın ve etanol yıkamalarına başlayın. Bileziklerin kabın içine yerleştirilmesini bozmamak için yavaşça döktüğünüzden emin olun.
- Bilezikleri 30 dakika boyunca% 99 etanolde iki kez yıkayın.
- Yakaları 1 saat% 100 etanolde yıkayın. Aşırı dehidrasyonu önlemek için yıkamaları zamanında değiştirdiğinizden emin olun.
- Bilezikleri RT'de metilbenzoat O/N'ye koyun. Metilbenzoatın buharlaşmasını önlemek için kabı parafilm ile kapatın.
- Metilbenozatı çeker ocaktaki uygun tek kullanımlık kaba dökün. Önceden hazırlanmış 1:1 düşük erime noktalı (56 - 57 °C), parafin mumu ve metilbenzoat karışımı ekleyin. Bu noktadan sonra, parafinin sertleşmediğinden emin olmak için tasmaların 65 °C'de bir inkübatörde tutulması gerekir.
- Metilbenozat ve parafin karışımını uygun tek kullanımlık kaba dökün ve 65 ° C'de tutulan erimiş saf parafin mumunu yakalara dökün.
- Parafini 30 dakika sonra değiştirin ve bunu en az 5 kez tekrarlayın. En az 6 - 8 yıkama yapılmalıdır.
- Yıkamalar tamamlandıktan sonra, bilezikleri, yaklaşık olarak bilezik büyüklüğünde yuvaları olan kauçuk bir buz küpü tepsisine yerleştirin. Tamamen kaplanana kadar üzerlerine erimiş parafin dökün ve O/N sertleşmesine izin verin (hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın).
- Tasmaları içeren parafin bloklarını buz küpü tepsisinden çıkarın. Parafin bloğunu bir tıraş bıçağı kullanarak bileziğin yakasından ayırın ve bileziği nazikçe kırın. Kafalar parafin bloğunda olacak, bedenler ise yakada kalacaktır. Bloklar oda sıcaklığında tutulabilir.
- Bilezikleri temizlemek için, parafini çıkarmak için 65 °C'de bir deparafinizasyon maddesine batırın, hafif ovma ile temizleyin ve tekrar kullanmadan önce etanolde yıkayın.
