Bu protokol, Nazario-Toole ve Wu'dan bir alıntıdır, Meyve Sineğinin Hücresel Bağışıklık Tepkisinin Değerlendirilmesi, Drosophila melanogaster, In Vivo Fagositoz Testi Kullanarak, J. Vis. Exp. (2019).
1. Floresein parçacıklarını enjeksiyon için hazırlayın
- 990 μL steril 1x PBS ve 10 μL 50 mM sodyum azid ekleyerek floresein ile etiketlenmiş 10 mg ticari olarak temin edilebilir, ısıyla öldürülmüş bakteri parçacıklarını 10 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden oluşturun. Karıştırmak için girdap.
- 0,2 mL'lik tüplerde tek kullanımlık 8 μL'lik alikotlara bölün ve ışıkla ilişkili hassasiyeti en aza indirmek için 4 °C'de karanlık bir kutuda saklayın.
NOT: Sodyum azid koruyucu isteğe bağlıdır ve 1 mL steril 1x PBS ile 10 mg / mL stoklar yapılırsa, alikote edilirse ve -20 ° C'de saklanırsa ihmal edilebilir.
- 500 μL şırınga filtrelenmiş yeşil gıda boyası ve 9,5 mL steril 1x PBS'yi karıştırarak 1x PBS'de 10 mL'lik %5'lik bir gıda boyası çözeltisi yapın.
- Sodyum azidi çıkarmak için enjeksiyondan önce parçacıkları yıkayın. 1.7 mL'lik bir tüpte 42 μL steril 1x PBS ve 8 μL 10 mg / mL'yi karıştırın. Oda sıcaklığında 2,5 dakika maksimum hızda santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın, 50 μL 1x PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 2,5 dakika maksimum hızda santrifüjleyin.
- Toplam 3 yıkama için 1.3 ve 1.3.1 adımlarını 2 kez tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, süpernatanı atın ve partikülleri 1x PBS'de 50 μL% 5 gıda boyasında 1.6 mg / mL'ye yeniden süspanse edin.
- Işıktan korumak için tüpü alüminyum folyoya sarın. 4 °C'de saklayın, 1 hafta sonra atın.
2. Enjeksiyon istasyonunu ve sinekleri hazırlayın
- Enjeksiyon pedini hazırlayın. Aynı anda 4 genotipe kadar sinek enjekte etmek için, dikdörtgen bir CO2 sinek pedini 4 bölüme ayırmak için laboratuvar bandı kullanın. Mikroskobun yanındaki tezgahta, sinekler pedin üzerine dizildikten sonra şişelerin yerleştirileceği alanları belirleyin (pedin her köşesi için bir tane).
- Yaşa uygun, 4-7 günlük, enjeksiyon için sinek şişeleri hazırlayın. Test edilecek her suş için, 5 erkek ve 5 dişiyi taze, etiketli hazırlanmış sinek yemi şişesine aktarın ve 25 ° C'de tutun.
- Cihazı 100 ms'ye ayarlayarak pnömatik enjektörü hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın - sıvıyı dışarı atmak için kısa gaz basıncı patlamaları - nanolitre altı hacimlerin verilmesine izin verir) ZAMANLI mod.
- Mikroskop slaytlarını hazırlayın. 1,5 inçlik elektrik bandı şeritleri kesin, yapışkan tarafı dışarıda olacak şekilde bir halka halinde katlayın ve etiketli bir mikroskop lamına yerleştirin.
3. Cam kılcal iğneleri hazırlayın
- Bir iğne çektirmesi kullanarak cam iğneleri (ince duvarlı cam kılcal damarlar) çekin.
- İğneyi mikroskop altında bir mikrometre ile tutun ve # 5 ince uçlu paslanmaz çelik cımbız kullanarak ucunu kırın. Yarayı en aza indirirken sineğin kütikülünü delmek için 100 μm uçlar yeterlidir.
- Her sineğin içine enjekte edilecek sıvının hacmini ölçün. İğneyi 1x PBS'de steril %5 gıda boyası ile yükleyin ve sıvıyı 0,01 mm aşamalı bir mikrometrede bir damla mineral yağ üzerine boşaltın.
NOT: Sıvı damlası küresel ise, pikolitre cinsinden hacim (boyut)3/1910 olarak hesaplanır. 100 μm çapında bir iğne 100 ms'de ~2 nL püskürtecektir.
4. Sinekleri enjekte edin
- 10 μL 1.6 mg / mL partikülleri küçük bir parafilm karesine pipetleyin.
- Sıvıyı iğneye çekin ve enjektör memesine monte edin (Malzeme Tablosuna bakın).
- CO2 ile uyuşturulmuş sinekler ve ventral tarafı yukarı bakacak ve başları pedin önüne doğru yönlendirilecek şekilde flypad üzerinde belirlenen alana hizalayın. Şişeleri tezgahın ilgili alanlarına yerleştirin.
- Karnın üst köşesine 5, 100 ms sıvı pompaları (toplam ~ 10 nL) ile sinek enjekte edin.
- Enjekte edilen sinekleri uygun şişelere aktarın, şişenin üzerindeki süreyi not edin. 25 °C'de tutun.
- % 0.4 Tripan Mavi Çözeltisi ile yeni bir iğne yükleyin.
- Pnömatik enjektörü, sıvıyı iğneden dışarı itmek için sabit bir hava akışına izin veren GATED'e ayarlayın.
- Sinekleri 30 dakika dinlendirdikten sonra uyuşturun ve karın dolana ve şişene kadar Tripan Mavisi enjekte edin.
NOT: PH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş parçacıklarla fagozom olgunlaşmasını incelerken, sineklerin 1 saat dinlenmesine izin verin ve sinekleri monte etmeden önce tripan mavisi enjekte etmeyin.
- Sinekleri elektrik bandı ile mikroskop slaytlarına ventral tarafı aşağı gelecek şekilde monte edin. Kanatları sineğin yanına itin ve banda sabitleyin. Ayrıca, sineğin hareket etmemesini sağlamak için kafayı yavaşça bandın içine itin.
