$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Bantel ve Tessier, Yetişkin Drosophila için Tat Tercihi Testi, J. Vis. Exp. (2016).
1. Açlık
- Standart bir sinek şişesinin dibinde bir pamuğu 18.2 MΩ su ile doyurarak sinek açlığı şişeleri hazırlayın. Alternatif olarak, benzer şekilde küçük bir filtre kağıdı şeridini 18.2 MΩ su ile doyurun ve şişenin içine belirli bir açıyla yerleştirin.
- Sinekleri bir CO2 pedi üzerinde ~ 100 hayvandan oluşan setler halinde toplayın ve ardından sinekleri hazırlanmış bir şişeye ekleyin.
NOT: En iyi sonuçlar 5 günlükten küçük hayvanlarda elde edilir. Bununla birlikte, hayvanların tam yaşı, zaman içinde tat tercihindeki değişiklikleri belirlemek için deneysel bir değişken olarak kontrol edilebilir.
- Şişeleri kapalı tutmak için bir pamuk top veya köpük tıpa kullanın. Şişeleri çevre kontrollü bir inkübatörde yan yana yerleştirin. Sıcaklığı 25 °C'de ve nemi% 70'in üzerinde tutun. Şişeleri 24 saat boyunca el değmeden bırakın.
2. Tat Tercihi Testi
- Test için tüm testleri testle aynı gün hazırlayın.
NOT: Kullanılacak kesin değerler, sorulan deneysel soruya bağlı olarak değişecektir. Aşağıdakiler, bu protokolde kullanılan örnek tastantlardır. Optimizasyonlar için bölüm 4'e bakın.
- 10 μl 100 mM sükroz çözeltisi, 13 μl kırmızı gıda boyası ve 977 μl 18.2 MΩ su birleştirerek kontrol tastantını (1 mM sükroz) hazırlayın.
- 50 μl 100 mM sükroz çözeltisi, 10 μl mavi gıda boyası ve 940 μl 18.2 MΩ suyu birleştirerek deneysel tastant (5 mM sükroz) hazırlayın.
- Aşağıdaki şekilde hazırlanmış standart 100 mm x 15 mm plastik petri kabı kullanarak tahlil odaları yapın:
- Saat 12 yönünde plakanın kenarına en yakın 10 μl'lik üç adet kontrol damlası ve saat 6 yönünde 3 damla daha yerleştirin. Damlalar arasındaki boşluğun benzer olduğundan emin olun.
- Saat 3 yönünde plakanın kenarına en yakın üç adet 10 μl'lik deneysel test damlası ve saat 9 yönünde 3 damla daha yerleştirin. Damlalar arasındaki boşluğun benzer olduğundan emin olun.
- İstediğiniz kadar çoğaltma için 2.2.1 ve 2.2.2 adımlarını yineleyin.
- Aç bırakılmış 1 şişe ~ 100 aç sineği tüm hayvanları uyuşturmaya yetecek kadar uzun bir süre (yaklaşık 10 saniye) bir CO2 pedine boşaltın. Hayvanları hazırlanmış bir tahlil odasının ortasına fırçalayın ve çanak kapağıyla örtün.
NOT: İyileşme süresini iyileştirmek ve beslenme davranışına müdahaleyi sınırlamak için daha uzun süreli CO2 maruziyetinden kaçınılmalıdır. Buza maruz kalma (~ 5 dakika), sınırlı maruziyetten bile kaynaklanabilecek CO2 davranışsal etkilerinden kaçınmak için anestezi için kullanılabilir.
- Tahlil odasını opak bir karton kutuya yerleştirin. Kutunun dışını test edilen durum ve genotip ile etiketlediğinizden emin olun.
- Tüm kurulumu (adım 2.4'ten itibaren karton kutu içinde bulunan tahlil odası) 2 saat boyunca en az %70 nem oranına sahip 25 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Tüm çoğaltmalar için 2.3 ile 2.5 arasındaki adımları yineleyin.
- 2 saat sonra, hala karton kutularda bulunan tahlil odalarını, kantitasyon için hazır olana kadar doğrudan -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
3. Tat Tercihi Deneyi Miktar Tayini
- Tek bir tahlil odasının oda sıcaklığına (yaklaşık 5 dakika) ısınmasına izin verin.
- Diseksiyon mikroskobu altında, bir fırça veya bir çift forseps kullanarak, hayvanları karın renklerine göre gruplandırın: kırmızı, mavi, mor veya berrak (Şekil 1).
- Her gruplamadaki hayvan sayısını kaydedin. Tahlillere katılmamış açık hayvanları düşünün ve bu nedenle onları herhangi bir hesaplamaya dahil etmeyin.
- Tercih indeksini aşağıdaki denklemlerden birine göre hesaplayın:
- İlgilenilen deneysel tastant kırmızı boyaya eklenirse, (Nkırmızı + 0.5Nmor)/(Nkırmızı + Nmavi + Nmor) kullanın.
- Deneysel tastant mavi boyaya eklenirse, denklemi (Nmavi + 0.5Nmor)/(Nmavi + Nkırmızı + Nmor) olarak ayarlayın.
- Tüm deneysel koşullar için hesaplamaları tekrarlayın ve çoğaltın.
4. Tat Tercihi Testinin Optimizasyonu
- Gıda boyasının tat tahlilinin sonucunu etkilememesi için kullanılacak gıda boyası göstergelerinin konsantrasyonunu ampirik olarak belirleyin:
- Adım 2.1'de belirtildiği gibi aynı baz bileşiğini (örneğin 5 mM sükroz) kullanarak 4 tatar hazırlayın, ancak gıda boyasını atlayın.
- Tastantlardan birine% 1.3 kırmızı gıda boyası ekleyin. Kalan 3 tastantı her tüpte farklı konsantrasyonlarda mavi gıda boyası ile yapın (örn. %0,6, %1 ve %1,3).
- Her bir tastant çifti için 2.2'den 3.4'e kadar olan protokol adımlarını tamamlayın: %1.3 kırmızıya karşı %0.6 mavi; %1.3 kırmızıya karşı %1 mavi ve %1.3 kırmızıya karşı %1.3 mavi.
- Tercih indeksinin ortalaması 0 olana kadar 4.1.1-4.1.3 adımını farklı mavi gıda boyası yüzdeleriyle tekrarlayın (Şekil 2).
NOT: Başlangıç noktası olarak, %1,3 kırmızı gıda boyası ve %1 mavi gıda boyası tipik olarak iyi sonuçlar verir. Tatmin edici bir mavi gıda boyası konsantrasyonu %1,3 boya ile eşleştirilemezse, 4.1.1'den 4.1.3'e kadar olan adımlar, değişen konsantrasyonlarda kırmızı renklendirme ve sabit bir mavi gıda boyası konsantrasyonu ile tekrarlanabilir.
- Aynı optimize edilmiş gıda boyası konsantrasyonları ile test edilecek tüm koşulları analiz edin.
