CApillary FEeder (CAFE) Testi: Drosophila'da Gıda Tüketimini ve Tercihini İzlemek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Diegelmann, S., et al. CApillary FEeder Testi, Drosophila melanogaster'de Gıda Alımını Ölçer. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, sınırsız meyve sineklerinin gıda alımını ve tercihini ölçen davranışsal bir yöntem olan CApillary FEeder veya CAFE testi açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, gıdayı vermek ve alımını izlemek için kullanılan sıvı dolu kılcal damarlardan minimum buharlaşma ile testin nasıl gerçekleştirileceğini gösterir.

Protokol

Bu protokol, Diegelmann ve ark., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. CApillary FEeder Testinin Montajı ve Gerçekleştirilmesi

1. Oruç tutulması gerekmiyorsa, deney sineklerini dokunarak veya üfleme borusu ile tahlillere aktarın. Buharlaşmayı ölçmek için sinek içermeyen üç kontrol şişesi eklediğinizden emin olun.
2. Dış açıklıklardan birini kapatan bir pipet ucunu (2 - 20 μL hacim) dikkatlice çıkarın ve önce alt ucu dolu bir cam kılcal damar yerleştirin. Pipet ucunu kılcal damarın yanına geri yerleştirerek kılcal damarı sabitleyin. Birden fazla gıda çözeltisi test ediliyorsa, bu prosedürü uygun şekilde tekrarlayın.
3. Gıda kaynaklarının farklı yüksekliklerde (kapaktan 3 - 4 cm) bulunması durumunda oluşabilecek sapmayı önlemek için kılcal uçları tüm şişelerin içine aynı seviyede yerleştirin; filtre kağıdına veya farklı viskozitelerdeki gıda kaynaklarına yanlışlıkla dokunarak kılcal damarın sızmasını önlemek için filtre kağıdına uzak durun.
4. Renkli sıvının üst ucunu bir işaretleyici kalem kullanarak etiketleyin (_{başlangıcı} işaretleyin). Farklı kılcal damarların tanımlanabilmesini sağlamak için, bunları bir renk veya şerit kodu kullanarak ayrı ayrı etiketleyin.
5. Birden fazla hazırlanmış CAFE tahlilini ızgaralı kakmalı plastik bir kutunun içine yerleştirin ve kutuyu (Şekil 2A) laboratuvar koşullarında veya sıcaklık, ışık ve nem kontrollü bir iklim odasında güvenli bir konuma aktarın (parametreler: 25 °C, %60 bağıl nem, 12 saat/12 saat aydınlık-karanlık döngüsü) deney süresi boyunca (örn. 3 saat veya gün).
6. Test birkaç gün içinde gerçekleştirilirse alt filtre kağıdı kuruduğundan, tahlil içindeki nemi sabit tutmak için sünger bant (100 μL) ile her 24 saatte bir taze su uygulayın. Nem cihazı olarak 30 mL ddH₂O ile doldurulmuş dört ayrı flakon (8 cm yükseklik, 3,3 cm çap) kullanın ve bunları plastik kutudaki CAFE tahlillerinin yanına yerleştirin. Deney sırasında nem kontrollü bir ortam oluşturmak için plastik kutu için bir kapak kullanın (Şekil 2A).
   NOT: Laboratuvar koşullarında daha geniş değişkenlik meydana gelir; bununla birlikte, CAFE testini oda sıcaklığında (örneğin bir sınıfta) yapmak mümkündür. Buharlaşmayı azaltmak için bir nemlendirme cihazının (ıslak sünger sapı olan veya olmayan filtre kağıdı, doldurulmuş su şişeleri ve plastik kutu kapağı) kullanılması şiddetle tavsiye edilir (Şekil 2B).
7. Her 24 saatte bir uzun süreli deneyler için kılcal damarları yeni doldurulmuş olanlarla değiştirin. Her 24 saatlik aralıktan önce ölü sinekleri not edin ve bir sonraki dönem için sinek başına tüketimi hesaplamak için canlı sinek sayısını kullanın. Menisküsün düşüşünü ölçtükten sonra eski kılcal damarları atın (bkz. 2.1).
   NOT: 3 saatlik bir deney sırasında neredeyse hiç ölü sinek görmüyoruz. 4 günlük bir çalışma sırasında genellikle 1 - 3 ölü sinek buluruz.
8. Testin sonunda veya kılcal damarı değiştirmeden önce, CAFE testi hala dik konumdayken kılcal damarın alt menisküsünü (işaret_ucu) bir işaretleyici kalemle işaretleyin. İşaret_sonu ilk işaretin altında değilse (işaret_{başlangıcı}) verileri atın. Menisküsü değiştirebileceği için kapağı çıkarmayın.
9. Kılcal damarları tahlilden dikkatlice çıkarın ve veri toplama için saklayın. Kılcal damarın içindeki sıvının alt uca ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin, aksi takdirde verileri atın, çünkü yiyecekler sinekler tarafından erişilebilir değildi. Flakon başına tüm kılcal damarları bir grup olarak toplayın. Sineklerin kaçmasını önlemek için kesilmemiş pipet uçlarını tüm açıklıklara yerleştirin. Kurulumu sökün ve şişeleri, kapakları ve sünger topaklarını bir sabun banyosunda yıkayın ve daha sonra kullanmak üzere gece boyunca oda sıcaklığında kurutun.
   NOT: Sinekler testten sonra daha fazla analiz edilebilir. Gözle veya diseksiyon mikroskobu altında gıda alımını onaylayın.
10. Aynı genotiplerle yapılan deneyleri en az üç farklı günde tekrarlayın.

2. Veri Toplama ve Analizi

1. Bir kumpas veya cetvel kullanarak kılcal damar üzerindeki işaret_{başlangıcı} ile işaret_bitişi arasındaki mesafeyi ölçün. Verileri doğrudan bir elektronik tabloya aktarmak için, USB (Evrensel Seri Veri Yolu) bağlantılı bir dijital kumpas (Şekil 1E) kullanın. Ölçümden sonra kılcal damarları atın.
2. Gıda alımını veya buharlaşmasını hesaplamak için kılcal damar boyutunu hesaba katın. Örneğin, 73 mm uzunluğunda ve 5 μL gıda çözeltisi içeren bir kılcal damar düşünün. Menisküste 14,6 mm'lik bir azalma, 1 μL'lik çözeltinin alımını yansıtır. Aşağıdaki formülü kullanarak gıda alımını hesaplayın:
   Gıda alımı (μL) = ölçülen mesafe (mm)/ 14,6 mm
3. Buharlaşmanın gıda alımı üzerindeki etkisini dışlamak için, sinek içermeyen üç (minimum) kontrol şişesindeki ortalama buharlaşmayı hesaplayın. Bu ortalama değeri, sinekler tarafından gıda tüketimi için elde edilen değerden çıkarın.
4. Uçuş başına toplam tüketimi belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
   Gıda tüketimi (μL) = (Gıda alımı [μL] - Evaporatif kayıp [μL])/şişedeki toplam sinek sayısı. Uzun süreli deneyler için, 24 saatlik aralığın başlamasından önce canlı olan sinek sayısını kullanın.
5. Erkek ve dişi sinekler gibi vücut büyüklüğündeki farklılıkları hesaba katmak için, gıda tüketimini vücut ağırlığına göre normalleştirin (μL gıda / mg sinek).
6. Veri analizi için istatistiksel yazılım kullanın. Normal dağılımlı veriler için, iki sinek grubu arasındaki farkları belirlemek için öğrencinin T-testlerini kullanın ve ikiden fazla grup için post hoc Tukey Cramer testleri ile ANOVA (varyans analizi) kullanın. Bir seçim durumunda, parametrik olmayan tek örnekli bir işaret testi kullanarak rastgele seçimden farklılıkları analiz edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Drosophila melanogaster CApillary FEeder Testi. A) Sinekler ile beslenme deneyi. Nemlendirilmiş filtre kağıdı, şişenin dibinde su sağlar. Deney sırasında dört kılcal damar sağlanır (zıt kılcal damarlarda kırmızı ve mavi renkli yiyecekler). Kılcal damarların ikinci bir pipet ucu ile yerine sabitlendiğini ve kullanılmayan konumların pipet uçları kullanılarak kapatıldığını unutmayın. Kapağı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Şişeler (üreme)	Greiner Bio-Bir	960177	www.greinerbioone.com
Şişeler (CAFE testi)	Greiner Bio-Bir	217101	www.greinerbioone.com
Lid-CAFE testi	atölye	-	-
Plastik kutu, alçak duvar	Plastime (Plastime)	353	www.plastime.it
Plastik kutu için kapak	atölye	-	-
Kapil	BLAUBRAND MARKASI	REFERANS: 7087 07	www.brand.de
Pipet uçları	Greiner Bio-Bir	771290	www.greinerbioone.com
Kağıt dairelerini filtreleyin	Ne adam	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D (+) - Sükroz	Uygulama Kimyası	57-50-1	www.applichem.com
Etanol mutlak	VWR Kimyasalları	20.821.330	www.vwr.com
Gıda boyası (kırmızı, E124)	Sırt eğlencesi	10027	www.backfun.de
Gıda boyası (mavi, E133)	Sırt eğlencesi	10030	www.backfun.de
Sabun çözeltisi (CVK 8)	Özgeçmiş	103220	www.cvh.de
Dijital kumpas	GARANT	412.616	www.hoffmann-group.com
Şişeler (üreme)			Yükseklik 9,8 cm, çap 4,8 cm
Şişeler (CAFE testi)			Yükseklik 8 cm, çap 3,3 cm
Lid-CAFE testi			Üniversite atölyesinde üretilen, teknik çizim sağlanan Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Plastik kutu, alçak duvar			Plastik bir ızgara dolgusu, 8 x 10 flakon pozisyonları için özel olarak üretildi
Plastik kutu için kapak			Boyutlar (37 x 29 x 18 cm)
Kapil			DIN ISO 7550 normu, IVD-yönerge 98/79 EG, uçları cilalı
Pipet uçları			Dış çember için pipetler kapağa göre kesilir
Kağıt dairelerini filtreleyin			45 mm çap, kullanılan şişeler için katlandığında iyi sonuç verir
D (+) - Sükroz			Zararlı değil
Etanol mutlak			Son derece yanıcı sıvı ve buhar
Gıda boyası (kırmızı, E124)			Belirtilmemiş
Gıda boyası (mavi, E133)			Belirtilmemiş
Sabun çözeltisi (CVK 8)			Koku nötr sabun
Dijital kumpas
Standart sinek yemi			(20 L için)
Ağar			160 gr
Bira mayası			299,33 gr
Mısır unu			1.200 gr
pekmez			1,6 L
Propiyonik asit			57,3 mL
Nipagin% 30			160 mL