Bu protokol, Tenenbaum ve Gavis, Duyusal Nöronların ve Epidermal Hücrelerin İmmünofloresan Analizi için Larva Filetolarından Drosophila Kas Dokusunun Çıkarılması, J. Vis. Exp.(2016).
NOT: Kas çıkarma prosedürü (Şekil 1), larva filetolarının hazırlanması için daha önce açıklanan yöntemlerin bir modifikasyonudur. Kasın çıkarılmasından önceki ve sonraki adımlar kısaca özetlenmiştir ve okuyucu, Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) ve Karim ve Moore, J. Vis. Exp. (2011) daha ayrıntılı açıklamalar için.
1. Larvaları soğuk tuzlu suda inceleyin
- Soğuk HL3.1 salin veya soğuk Ca2 + içermeyen HL3.1 salinin çalışma seyreltmesini hazırlayın (Tablo 1). Larvaları, tabağın altını kaplayacak kadar soğuk tuzlu su ile silikon elastomer bir tabağa yerleştirin.
NOT: Larva diseksiyonu sırasında standart HL3.1 salin yerine Ca2+ içermeyen HL3.1 salin kullanımını denemenizi öneririz. Kalsiyum yokluğunda, larva kas kasılmaları büyük ölçüde azalır. Bu nedenle, larva filetolarının Ca2 + içermeyen HL3.1 salin içinde diseke edildiğinde manipüle edilmesi daha kolay olabilir. Bununla birlikte, kas kasılmasının kas ve epidermis arasında boşluk yarattığını ve bunun epidermise zarar verme riskini en aza indirirken bu dokular arasına forseps yerleştirilmesini kolaylaştırabileceğini bulduk. Sonuç olarak, epidermis ve da nöronlarının bütünlüğünü korumak için standart HL3.1 tercih edilebilir. Her iki tuzlu su ile de iyi sonuçlar elde ediyoruz ve seçim kullanıcıya bırakılıyor.
- Larvaları ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Larvaların ventral yüzeyi, abdominal diş kayışları ve dorsal taraf, önden arkaya uzanan primer larva trakeal tüpleri ile tanımlanabilir. Larvaları ön-arka yönde gerin ve başı ve kuyruğu böcek pimleri kullanarak silikon elastomer diseksiyon kabına sabitleyin. Ventral orta hat boyunca kesmek için ince diseksiyon makası kullanın, bir uçtan başlayıp diğer uca doğru ilerleyin.
NOT: Bu yönelim, yaygın olarak incelenen da nöronlarının dorsal kümesini korur.
- Larva kesilerek açıldıktan sonra, dört köşeyi bir kitap açıyormuş gibi diseksiyon kabına sabitleyin. CNS, bağırsak ve trakea dahil olmak üzere iç organları tutmak ve çıkarmak için forseps kullanın. Böcek pimlerini, fileto gergin olacak ancak maksimum derecede gerilmeyecek şekilde ayarlayın.
NOT: Kaslar, segmental sınırlarda vücut duvarına sabitlenir. Kaslar vücut duvarının çoğunu kaplamasına rağmen, sırt orta hattına yakın dar bir bölgede yoktur.
2. Kas Kaldırma
- Kas dokusunun bulunmadığı larvaların dorsal orta hattını bulun. Tek bir forseps çatalını, mümkün olan en düz yönde kas dokusunun altına yerleştirilebilecek şekilde konumlandırın.
- Dorsal orta hattan başlayarak, segmentin ön sınırına yakın, forseps ve epidermis arasındaki teması en aza indirmeye dikkat ederek, forseps ucunu kas ve epidermis arasında dikkatlice kaydırın.
- Kasın vücut duvarına olan bağlantısını bir ankraj noktasında kırmak için forsepsleri yukarı doğru çekin. İlgilenilen kalan yarım segment(ler) için bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Bu protokol, her bir da nöron dendrit alanının arka kısmının korunmasını optimize eder. Dendrit alanının ön kısmını korumak için, forseps ucunu her segmentin arka ucuna yerleştirmek en iyisidir.
- Böcek pimlerini, larva filetosu her yöne maksimum şekilde gerilecek şekilde yeniden ayarlayın.
- PBS'de 25 dakika boyunca soğuk, taze hazırlanmış %4 formaldehit kullanarak filetoyu hala diseksiyon kabına sabitlenmiş durumdayken sabitleyin.
- PBS'de 5 kez durulayın.
- Epidermis ile teması en aza indirmeye özen göstererek, kalan ankraj noktalarından kas dokusunu dikkatlice çekmek için forseps kullanın.
- Filetoyu diseksiyon kabından 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarın ve çıkarın. Daha önce Karim ve Moore, J. Vis. Exp. (2011).
