Bu protokol, Reimels ve Pfleger, Drosophila Larvalarında Lenf Bezi ve Hemositleri İnceleme Yöntemleri, J. Vis. Exp. (2016).
1. Larva Lenf Bezi İmmünohistokimyası
NOT: Lenf bezi, sırt tarafında beynin biraz altında bir larvanın ön ucundan yaklaşık üçte bir uzunlukta bulunur. (Şekil 1 B'deki oka bakın.) Lenf bezi sırt damarını çevreler ve en kolay şekilde disseke edilir, ağız kancalarına veya beyne bağlanır. Vahşi tip, üçüncü instar lenf bezleri çok küçük yapılardır; Birincil loblar yaklaşık 100 - 200 μm uzunluğundadır. (Bkz. Şekil 2A.)
- Bu tahlil için kabaca aynı gelişim aşamasına sahip larvaları elde etmek için, dişilerin 2-6 saatlik sabit bir süre boyunca yumurta bırakmasına izin vererek yumurta toplamayı kısıtlayın.
- Lenf bezi diseksiyonu
- Her deneysel koşul için, 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna 1 ml 1x PBS (Tablo 1) ekleyin.
- Tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanarak her oyuğa 1 damla %0.1 PBST (Tablo 1) ekleyin.
NOT: Yüzey gerilimini düşürmek için Tween 20 gibi deterjan eklenir ve dokunun kuyunun dibine çökmesini sağlar.
- Plakayı buzun üzerine düz bir şekilde yerleştirin.
- Larvaları 1x PBS ile doldurulmuş diseksiyon kabı kuyularında toplayın.
- Işıklı bir stereomikroskop tabanına temiz bir diseksiyon pedi yerleştirin. Pedin üzerine küçük damlalar %0.01 PBST (Tablo 1) yerleştirmek için tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın. Diseksiyon için bir larvayı bir PBST damlasına aktarın.
- Larvaları, sırt tarafı yukarı, arka uçtan yaklaşık dörtte bir uzunlukta bir çift forseps ile tutun.
- Larvaları tutan forsepslerin hemen önündeki kütikülü tutmak için başka bir forseps çifti kullanın. Ağız kancaları ortaya çıkana kadar kütikülü yavaşça ön uca doğru çekin.
NOT: Amaç herhangi bir iç yapıyı bozmadan kütikülü soymaktır.
- Kütikülü serbest bırakın ve larvaları ikiye kesmek için her iki forseps kullanın. Arka ucu PBST damlasından çıkarın.
NOT: Kütikül ağız kancalarına kadar soyulmazsa, larvaları ikiye bölün ve arka ucunu çıkarın. Kütikülün kenarını tutmak için bir çift forseps kullanın ve ağız kancalarını açıklıktan itmek için diğer forseps çiftini kullanın. Bu, kütikülü ters çevirecek ve ağız kancalarını ortaya çıkaracaktır. Bu alternatif bir diseksiyon yöntemi olarak da kullanılabilir.
- Stabilite için kütikülü (ventral kütikül, dorsal kütikül flebi veya her ikisi) sabitlemek için bir çift forseps kullanın.
- Açıkta kalan ağız kancalarını tutmak için başka bir forseps kullanın ve nazikçe dışarı çekin.
NOT: Bu, kütikülü iç yapılardan ayıracaktır. İdeal olarak, sırt damarını çevreleyen göz/anten hayali diskleri, beyin, halka bezi ve lenf bezi ağız kancalarına bağlı kalacaktır.
- Ağız kancalarını tutmaya devam ederken tükürük bezleri, yağ gövdesi ve bağırsak gibi istenmeyen yapıları dikkatlice çıkarın.
NOT: Beyin ağız kancalarından ayrılırsa, lenf bezi hala beyne bağlı olabilir ve beyinle birlikte toplanabilir. Bu durumda, ağız kancaları yerine ventral sinir kordonunu tutun.
- Ağız kancalarını veya ventral sinir kordonunu tutamak olarak kullanarak, lenf bezini içeren disseke edilmiş kompleksi buz üzerindeki kuyuya aktarın. Fiksasyondan önce 30 dakikayı aşmayın.
- Fiksasyon ve immünohistokimya
- 24 oyuklu plakayı stereomikroskop tabanına yerleştirin.
- PBST'yi kuyudan dikkatlice çıkarmak için bir p200 pipeti kullanın.
NOT: Boş, komşu kuyular, atıkları geçici olarak biriktirmek için kullanışlıdır.
- Kuyunun kenarına nazikçe 200 μl% 3.7 formaldehit (Tablo 1) ekleyin ve diseke edilen dokuların tamamen suya batırıldığından emin olmak için plakayı döndürün.
- Plakayı 30 dakika buza geri koyun. Lenf bezleri floresan protein(ler)i eksprese ediyorsa, fotoağartmayı önlemek için plakayı kapalı tutun.
- Sabitleyiciyi dikkatlice çıkarmak için bir p200 pipeti kullanın.
- Kuyucuğa 200 μl 1x PBS ekleyerek ve plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirerek yıkayın. PBS.
dikkatlice çıkarmak için bir p200 pipeti kullanın.
NOT: Sabit lenf bezleri, tüm deneysel koşullar için lenf bezleri diseke edilip sabitlenene kadar PBS'de buz üzerinde bırakılabilir.
- Yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
- Kuyuya 200 μl geçirgenlik çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. Plakayı RT.
'de 45 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcıya ayarlayın
NOT: 45 dk, lenf bezi geçirgenliği için "altın standart"tır, ancak yazarlar sadece 20 dk sonra başarılı olurlar.
- Solüsyonu bir p200 pipeti ile çıkarın.
- Birincil antikoru, sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi (Tablo 1) ile seyreltin. Kuyucuğa 300 μl primer antikor çözeltisi ekleyin ve diseke edilen dokuların tamamen suya batırıldığından emin olun. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Primer antikoru çıkarmak için bir p200 pipeti kullanın.
- Kuyucuğa 200 μl 1x PBS ekleyerek ve plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirerek yıkayın. PBS'yi dikkatli bir şekilde çıkarmak için bir p200 pipeti kullanın.
- Yıkama adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
- İkincil antikoru, sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi ile seyreltin. Kuyucuğa 300 μl ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve diseke edilen dokuların tamamen suya batırıldığından emin olun. RT'de en az 2 saat orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- İkincil antikoru çıkarmak için bir p200 pipeti kullanın ve Adım 1.3.12 ve 1.3.13'te açıklandığı gibi yıkayın. Son yıkamadan sonra PBS'yi çıkarmayın.
- Lenf bezi montajı
- % 70 etanol (Tablo 1) ve mendil kullanarak cam mikroskop slaytlarını temizleyin.
- Her deney koşulu için, cam kızağın üzerine bir damla montaj tamponu (Tablo 1) yerleştirin.
NOT: Bir slayta iki koşul sığar. Montaj tamponu hacmi, monte edilecek lenf bezlerinin sayısına bağlıdır. Yaklaşık 18 - 20 lenf bezi için 2 μl, 10 - 12 için 1 μl ve 5 veya daha azı için 0,5 μl kullanın.
- Mikroskop slaytını aydınlatmalı bir stereomikroskop tabanına yerleştirin.
- Bir seferde en fazla iki koşul için, ağız kancalarını veya ventral sinir kordonunu tutamak olarak kullanarak, tüm lenf bezlerini kuyudan forseps ile montaj tamponuna aktarın.
- Diseke edilen dokuları dairesel veya dikdörtgen bir şekilde eşit şekilde yerleştirin ve işlem sırasında montaj tamponunu yayın.
- Diseke edilen dokuların her biri için, ayrı ayrı, forsepsin bir tonunu dorsal damarın altına kaydırın ve yavaşça montaj tamponunun çevresine doğru çekin.
NOT: Bu, lenf bezini diseke edilen dokuların geri kalanından çekecek ve lenf bezini cam üzerinde düzleştirecektir.
- Bir maşa forseps ve testere hareketi kullanarak, lenf bezi ile beyin arasındaki sırt damarını kesin.
- Diseke edilen dokuların geri kalanını, tamponun en dış kenarında, lenf bezinin karşı tarafına taşıyın.
NOT: İstenmeyen diseke dokular sonunda lenf bezlerinin etrafında bir çevre oluşturacak ve lamel üzerinde duracak bir destek görevi görecektir.
- Tüm lenf bezleri diseke edilen dokulardan ayrılana kadar tekrarlayın ve istenmeyen disseke edilmiş dokulardan birini merkeze yerleştirmek için ayırın.
- İki parmağınızın arasına bir lamel alın. Lamelin toz ve parmak izi içermediğini kontrol edin. Gerekirse, lamel temizlemek için bir mendil ve% 70 etanol kullanın.
- Lamelin kenarının cam sürgünün kenarına paralel olduğundan emin olarak, lameli montaj tamponunun üzerine dikkatlice indirin.
NOT: Mikroskop lamları görüntülemeden önce 4 °C'de saklanabilir. Maksimum saklama süresi, kullanılan antikorların stabilitesine bağlıdır. 24 oyuklu plakalar durulanabilir ve tekrar kullanılabilir.
2. Görüntüleme
- Sabit hemositleri ve monte edilmiş lenf bezlerini, üreticinin kullanım kılavuzuna göre 20X veya daha yüksek büyütme oranlarında uygun bir standart floresan veya konfokal mikroskopta görüntüleyin. Üreticinin kullanım kılavuzuna göre tüm larvaları standart bir stereomikroskopta 2X büyütmede görüntüleyin.
- İsterseniz, evrişimi kaldırma için yazılım sağlayıcısının talimatlarını izleyin.
