Bu protokol, Kelly ve ark., Yetişkin Drosophila melanogaster Beyinlerinde Mantar Gövdesi ve Fotoreseptör Nöronlarının Diseksiyonu ve İmmünofloresan Boyama, J. Vis. Exp. (2017).
1. Diseksiyon İstasyonu Hazırlığı
- Stereomikroskobu ve ışık kaynağını fiber optik kuğu boyunlu olarak büyük bir tezgah üzerine yerleştirin. Sabit el hareketlerini teşvik etmek ve diseksiyon sırasında el "titremesini" azaltmak için, mikroskop çevresinde yeterli el ve kol dayanağı alanının bulunması önemlidir. Mikroskobun her iki tarafında yaklaşık 8 - 10 inç ve mikroskobun tabanı ile tezgahın kenarı arasında 4 - 6 inç olduğundan emin olun.
- 2 veya 3 kuyulu bir cam 9 kuyulu veya 3 oyuklu kabı 1.0 mL PTN tamponu (0.1 M Sodyum Fosfat Tampon pH 7.2, %0.1 noniyonik yüzey aktif madde, tam tampon bileşenleri için Malzeme Tablosuna bakınız) ile doldurun ve buz üzerindeki diseksiyon istasyonunun yanına yerleştirin. Yeni diseke edilen beyinler bu çanağa aktarılacak ve fiksasyon aşamasına kadar saklanacaktır.
NOT: Canlı görüntüleme gerekiyorsa, diseksiyon tamponu 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) veya HL3 tamponu olmalıdır. Hücre içi protein lokalizasyonu gerekiyorsa, PBS diseksiyon ve fiksasyon için alternatif bir tampon olarak da kullanılabilir. Fiksasyonu takiben, hücre zarlarının geçirgenliği daha sonra %0.1 veya %0.3 noniyonik deterjan içeren PTN yıkamaları kullanılarak yapılmalıdır.
- Diseksiyon ve fiksasyon için PBS kullanılıyorsa, mikrosantrifüj tüplerine aktarım sırasında beyinlerin plastik pipet uçlarına yapışmasını önlemek için pipet uçları deterjan içeren bir tamponla (PTN gibi) en az bir kez durulanmalıdır.
- 35 mm'lik boş bir cam veya plastik petri kabı kullanarak, silikon elastomer içeren bir diseksiyon kabı oluşturun. Kısaca, elastomer bileşenlerini üreticinin talimatlarına göre karıştırın, 35 mm'lik tabaklara dökün ve gece boyunca düz bir yüzeyde polimerize olmasına izin verin. Elastomer içeren diseksiyon tabakları, forseps ile cam tabak gibi daha sert bir yüzey arasında temas edildiğinde kolayca zarar görebilen diseksiyon forsepslerinin ince uçlarını korumak için kullanılmalıdır. Ayrıca çevrimiçi perakendecilerden düzenli olarak ticari olarak temin edilebilen silikon kaplı tabaklar satın alıyoruz. Diseksiyonlar sırasında kontrastı artırmak için, inaktive edilmiş odun kömürü (ve dolayısıyla siyah renkli) içeren silikon elastomer diseksiyon kapları özellikle yararlıdır.
2. Erişkin Beyin Diseksiyonu Prosedürü
- 3-5 günlük yetişkin D. melanogaster'i CO2 ile veya buz kullanarak uyuşturun. Buz kullanıyorsanız, sinek içeren şişeyi baş aşağı (fiş ucu aşağı) ~ 5 dakika boyunca bir buz kovasına yerleştirin. Şişeyi baş aşağı buza yerleştirmek, sineklerin yiyeceğe sıkışmasını önler. Sinekler uyuşturulduktan sonra, sinekleri buzda oturan soğuk bir metal ped veya petri kabına veya CO2 yayan bir sinek pedine yerleştirin. Nörodejenerasyonu analiz etmek için beyinleri inceliyorsa, yaşlı sinekler de kullanılabilir.
Bir - PTN "kabarcığı" oluşturmak için bir transfer pipeti veya bir p200 pipeti kullanarak diseksiyon kabının ortasına küçük miktarda (150 - 200 μL) PTN yerleştirin. Diseksiyon çanağını stereomikroskobun altına yerleştirin ve aydınlatmayı ve odağı, PTN baloncuğu görüş alanını dolduracak ve eşit şekilde aydınlatılacak şekilde ayarlayın.
- Sinekleri, metal veya CO2 pedi üzerinde yatarken "göbek yukarı" (yani ventral tarafı yukarı) olacak şekilde manipüle edin.
- Bir çift # 5 forseps kullanarak, diseke edilecek bir sineğin karnını kavrayın ve sineği tutarak, diseksiyon kabındaki PTN'ye tamamen daldırın.
NOT: Protokolün geri kalanı için, kafa PTN'ye daldırılmışken tüm adımlar gerçekleştirilmelidir.
- İkinci bir çift # 5 forseps kullanarak, sinek hortumunun tabanını kavrayın ve sinek kafasını vücuttan ayırmak için iki çift forseps ayırın. Karın ve göğüs kafesi atın. Bu adım sırasında, kafanın serbest bırakılmaması ve PTN'nin yüzeyinde yüzmesine izin verilmemesi çok önemlidir. Kafa bir kez yüzerken, beyni ezmeden tekrar kavramak çok zor olabilir.
NOT: Bu yöntem kullanılarak beyin ile ventral sinir kordonu arasındaki bağlantılar koparılır. CNS'nin bu bölgeleri arasında sağlam bağlantılar gerekiyorsa, alternatif bir diseksiyon protokolü izlenmelidir. Hortum, kafa çıkarılmadan önce sinek kafasından ayrılırsa, hortumun olduğu yerde bir delik olacaktır. Bu durumda, sinek kafasını bir gözün yanındaki deliğin kenarından kavrayın. Ardından, iki forseps çiftini birbirinden ayırırken orta derecede bir kuvvet kullanarak kafayı çıkarın. Bazen, kafa vücuttan çıkarıldığında, bağırsak ve / veya ventral sinir kordonu başa bağlı kalır ve diseksiyona devam etmeden önce çıkarılmalıdır.
- Bir çift forseps hortumu kavrarken, ikinci çift sağ sinek gözünün medial kenarını kavramalıdır. Yavaşça forsepsleri birbirinden ayırın. Bu adım, az miktarda sabit yanal kuvvet ile gerçekleştirilmelidir. Forsepsler yavaşça birbirinden ayrılırken, hortum kafadan çekilmeli ve kafa kütikülünde merkezi bir delik oluşturmalıdır. Sağ gözün medial kısmını ikinci çiftten serbest bırakmadan hortumu ilk forseps çifti ile atın.
NOT: Erişkin D. melanogaster beyni, sinek kafasının kaudal (yani arka/arka) bölgesindedir. Bu nedenle başın o bölgesini kavramaktan kaçınılmalıdır. İdeal olarak, başın medial retinaya yakın sadece rostral (yani ön) kısmı forseps tarafından doğrudan kavranmalıdır. Beyin ve ilgili trakea artık kütiküldeki merkezi delikten görülebilmelidir. Bu sırada, delikten çıkıntı yapan herhangi bir beyaz lifli trakea ipliği çıkarılabilir ve atılabilir.
- İkinci forseps çifti ile sol retinanın medial kenarını (kafa kütikülündeki merkezi deliğin kenarında) kavrayın. Retinaları ve ilgili kütikülü çıkarmak için forsepsleri 180°'lik bir açıyla yavaşça birbirinden uzaklaştırın. Retina alttaki optik lobdan ayrıldıkça, gerginlikte hafif bir azalma hissetmelisiniz. Optik lobun yırtılmasını önlemek için yavaşça ilerleyin.
NOT: Bu aşamada forsepslerin çok hızlı bir şekilde ayrılması, optik lobun yırtılmasına veya mantar vücut yapılarının bozulmasına neden olabilir. Bazen, kütikül çıkarılır, ancak retina parçaları optik loba bağlı kalır. Mantar cisimcikleri görüntüleniyorsa, tüm retinanın tamamen çıkarılması gerekli değildir. Bununla birlikte, diğer beyin bölgelerinin analizi (optik beyin loblarının retinal nöron innervasyonu gibi), retinanın tarif edildiği gibi tamamen çıkarılmasını gerektirebilir.
NOT: Retina, beynin alttaki optik lobundan yavaşça ayrıldığından, optik lob beyaz, lifli trakea ile kaplı opak beyaz bir yapı olarak gözlenebilir olmalıdır. Bir retina çıkarıldıktan sonra atılabilir. Retinal nöronların yol bulmasını analiz ederken, optik lobun hasar görmesini önlemek için bu adım sırasında özel dikkat gösterilmelidir. Fotoreseptör nöronlarının diseksiyonu ve canlı görüntülenmesine odaklanan ek bir protokol de mevcuttur.
- Şimdi, görünür trakeanın mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın. Trakea zaten hava içerebilir veya daha sonra hava ile dolabilir, bu da beyinlerin yüzmesine ve potansiyel olarak daha sonraki immün boyama adımları sırasında kaybolmasına neden olabilir. Trakeayı çıkarmak için, çok keskin bir çift # 5 forseps kullanarak beyinden çıkarın.
- Sol sinek retinasının medial bölgesini kavramak için her iki forseps çiftini kullanarak kalan retinayı ve çevresindeki kütikülü çıkarın. Retina ve kütikül parçalarını çıkarmak için retinayı dikkatlice ikiye bölün. Bazı durumlarda, beyni ezmeden kalan kütikülü çıkarmak özellikle zordur. Bu durumlarda, ventral sinir kordonunun kalan ipliklerinin bunun yerine bir çift forseps tarafından kavranabildiğini, diğer forseps çiftinin ise kütikülün sonunu dikkatlice çıkarmak için kullanıldığını bulduk.
- Bir p200 pipeti kullanarak, disseke edilmiş beyinleri PTN içeren 9 veya 3 oyuklu tabağın bir oyuğuna taşıyın. Aynı genotipe sahip beyinler aynı kuyuda bir araya getirilmeli ve buz üzerinde tutulmalıdır. Beyin dokusu diseksiyondan sonraki bir saat içinde düzeltilmelidir. Beyinler küçük gruplar halinde sabitlenebilir ve daha fazla sayıda beyin gerekiyorsa bir araya getirilebilir. Çoğu durumda, deneyimli bir araştırmacı genellikle bir beyni parçalara ayırabilir ve yaklaşık 3-5 dakika içinde cam toplama kabına aktarabilir.
