$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Koyle ve ark., Meyve Sineği Drosophila melanogaster'in Aksenik ve Gnotobiyotik Koşullar Altında Yetiştirilmesi, J. Vis. Exp.(2016).
1. Yumurtlama Kafeslerini Hazırlayın
- 100 ml su, 10 gr bira mayası, 10 gr glikoz ve 1 gr agar mikrodalgada pişirerek üzüm suyu agar tabakları yapın. Adım 1.1'de 3 kez kaynatın ve yumurtaların agar plakası üzerindeki görünürlüğünü artırmak için 10 g donmuş üzüm suyu konsantresi ekleyin.
- Agar 55 °C'ye soğuduğunda, 100 mm'lik Petri kaplarına 20 ml dökün ve katılaşmasına izin verin.
- 1 g bira mayasını 15 g su ile karıştırarak agar plakalarının yüzeyini bir maya macunu ile kaplayın. Yüzeyin kaplandığından emin olarak maya macununu agar plakasına dökün, ardından fazlalığı dökün ve geride ince bir maya kalıntısı bırakın. Birden fazla plaka kullanılıyorsa, macun sırayla birden fazla plakaya dökülebilir.
- Agar plakalarını bir kafesin dibine aktarın.
NOT: 32 oz'luk bir şarküteri kabı, akrilik sinek kafesleri için iyi bir alternatiftir.
- Üstte bir delik açarak ve toksik olmayan yapıştırıcı ile deliğin üzerine nefes alabilen bir ağ yapıştırarak 32 oz şarküteri kapları için kapaklar yapın. Yapıştırıcı suda çözünürse, kapağın suya maruz kalmasını önleyin.
- 200-300 sineği kabın içine aktarın ve kapakla kapatın. Agar yüzeyinden buharlaşmayı önlemek için ağ korumalı deliği boş bir Petri kabı kapağı ile kapatın ve istenirse kapağın içine nemli bir kağıt mendil ekleyin. Sinekleri gece boyunca 25 ° C'de 16-20 saat kuluçkaya yatırın.
2. Yumurtaları Toplayın
- Naylon ağı plastik bir burcun içine yerleştirerek yumurta toplama için bir elek hazırlayın.
- Üzerinde yumurta bulunan tabağı almak için, boş bir kaba aktararak sinekleri kafesten çıkarın. Ertesi gün aynı sinekler kullanılacaksa, hemen taze mayalı üzüm suyu agar tabağı içeren yeni bir kafese aktarın. Sinekler 3-5 ardışık gün boyunca kullanılabilir
- Agarın parçalanmamasına dikkat ederek temiz bir boya fırçası ile agardaki ölü sinekleri çıkarın.
- Agar plakasını damıtılmış suyla durulayarak, agar yüzeyinden yumurtaları nazikçe fırçalayarak ve bulamacı ağın üzerine dökerek yumurtaları toplayın. Yumurtaların tamamı veya çoğu agar plakasından çıkarılana kadar 3-4 kez tekrarlayın.
3. Yumurtaları Dekoryonat ve Steril Diyete Aktarın
- Biyogüvenlik kabininin iç kısmına (yanlar dahil) %70 etanol püskürterek hazırlayın. Altını bir laboratuvar mendiliyle silin ve başlığı UV ışığıyla ~ 15 dakika sterilize edin. Biyolojik olmayan tüm malzemeleri (numune kapları, boya fırçası, forseps, atık kabı, 400 ml sterilize su ve 100 ml %0,6 sodyum hipoklorit) etanol püskürterek ve hemen biyogüvenlik kabinine yerleştirerek sterilize edin. UV ışığı ile 15 dakika sterilize edin.
- 2 sodyum hipoklorit yıkamanın ilkine, yumurtalarla birlikte kovanı 120 ml'lik bir numune kabına veya başka bir steril kaba yerleştirerek başlayın. ~ 90 ml% 0.6 sodyum hipoklorit çözeltisini, kenarın hemen altına kadar burcun içine yavaşça dökün.
- Yumurtaları 2,5 dakika durulayın. Burcu hipoklorit çözeltisinde yukarı ve aşağı hareket ettirmek için forseps kullanarak yumurtaları periyodik olarak yeniden askıya alın.
- Burcu doğrudan biyogüvenlik kabininin içinde 90 ml çamaşır suyu ile önceden doldurulmuş ikinci bir numune kabına aktarın.
- Biyogüvenlik kabini içinde adım 3.3'ü tekrarlayın. İkinci ağartma işleminin sonunda, yumurtalar burcun kenarlarına yapışmaya başlamalıdır.
- Biyogüvenlik kabininde 3.7-3.8 adımlarını uygulayın.
- Çamaşır suyunu atın ve burcu 3 kez steril suyla yıkayın. Burcu forseps ile hareket ettirerek her yıkama sırasında yumurtaları birkaç kez tekrar askıya alın. Üçüncü yıkamanın sonunda, çoğu yumurta burcun yan tarafına tutturulmalıdır.
- Etanol içinde sterilize edilmiş bir boya fırçası kullanarak, yumurtaları burcun yanından steril diyete aktarın. Yumurtaları tek tek veya küçük gruplar halinde aktarın. Flakon başına 30-50 yumurta hedefleyin. Oksijenin tüpe girmesine izin vermek için kapakları gevşek bırakın.