$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Koyle ve ark., Meyve Sineği Drosophila melanogaster'in Aksenik ve Gnotobiyotik Koşullar Altında Yetiştirilmesi, J. Vis. Uzm. (2016).
1. Yumurtaları Dekoryonat ve Steril Diyete Aktarın
- Biyogüvenlik kabininin iç kısmına (yanlar dahil) %70 etanol püskürterek hazırlayın. Altını bir laboratuvar mendiliyle silin ve başlığı UV ışığıyla ~ 15 dakika sterilize edin. Biyolojik olmayan tüm malzemeleri (numune kapları, boya fırçası, forseps, atık kabı, 400 ml sterilize su ve 100 ml %0,6 sodyum hipoklorit) etanol püskürterek ve hemen biyogüvenlik kabinine yerleştirerek sterilize edin. UV ışığı ile 15 dakika sterilize edin.
- 2 sodyum hipoklorit yıkamanın ilkine, yumurtalarla birlikte kovanı 120 ml'lik bir numune kabına veya başka bir steril kaba yerleştirerek başlayın. ~ 90 ml% 0.6 sodyum hipoklorit çözeltisini, kenarın hemen altına kadar burcun içine yavaşça dökün.
- Yumurtaları 2,5 dakika durulayın. Burcu hipoklorit çözeltisinde yukarı ve aşağı hareket ettirmek için forseps kullanarak yumurtaları periyodik olarak yeniden askıya alın.
- Burcu doğrudan biyogüvenlik kabininin içinde 90 ml çamaşır suyu ile önceden doldurulmuş ikinci bir numune kabına aktarın.
- Biyogüvenlik kabini içinde adım 1.3'ü tekrarlayın. İkinci ağartma işleminin sonunda, yumurtalar burcun kenarlarına yapışmaya başlamalıdır.
- Biyogüvenlik kabininde 1.7-1.8 adımlarını gerçekleştirin.
- Çamaşır suyunu atın ve burcu 3 kez steril suyla yıkayın. Burcu forseps ile hareket ettirerek her yıkama sırasında yumurtaları birkaç kez tekrar askıya alın. Üçüncü yıkamanın sonunda, çoğu yumurta burcun yan tarafına tutturulmalıdır.
- Etanol içinde sterilize edilmiş bir boya fırçası kullanarak, yumurtaları burcun yanından steril diyete aktarın. Yumurtaları tek tek veya küçük gruplar halinde aktarın. Flakon başına 30-50 yumurta hedefleyin. Oksijenin tüpe girmesine izin vermek için kapakları gevşek bırakın. Şişeler aksenik kalacaksa, bir böcek inkübatörüne aktarın; Aksi takdirde, aşağıdaki gibi bakteri ekleyin.
2. 4 bakteri türü kullanarak gnotobiyotik sinekler yapın
- Bakterileri Hazırlayın
- Adım 1.1'deki gibi gerekli malzemelerle (pipetler, pipet ucu kutuları, sterilize santrifüj tüpleri, MRS suyu ve test tüpü rafları) sterilize edilmiş bir biyogüvenlik kabini hazırlayın. Biyogüvenlik kabinine yerleştirmeden önce test tüplerinin dışını etanole batırılmış bir laboratuvar mendiliyle silin.
- Önce 500 μl gece boyunca büyümeyi steril bir mikrofüj tüpüne aktararak bakterileri peletleyin. Bakteri yoğunluğu düşükse, her tüpe 1.5 ml'ye kadar ekleyin veya sırayla süpernatanı çıkarın ve aynı tüpe ekstra kültür ekleyin. Numuneleri biyogüvenlik kabininden çıkarın ve 10.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Numuneler arasında kontaminasyonu önlemek için filtre uçlarını kullanın.
- OD600'ü ölçerek her kültürün yoğunluğunu belirleyin. Çok kuyulu bir plaka okuyucu kullanılıyorsa, her kültürün 200 μl'sini 1, 2 ve 4 katlı seyreltmelerde 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
- Bir plaka okuma spektrofotometresi ve aşağıdaki denklemleri kullanarak her bir hücre peletinin (2.1.2) seyreltileceği mMRS miktarını belirleyin. Her sinek şişesine 50 μl aşılamak için yeterli et suyu eklemeyi planlayın.
- Bir plaka okuma spektrofotometresinde her bakteri kültürünün 1: 1, 1: 2 ve 1: 4 seyreltilmesi için OD600 okumalarını toplayın. 0.1 ile 0.2 arasında bir OD600 değeri üreten her bakteri suşu için seyreltmeyi seçin ve bu değeri ve karşılık gelen seyreltme faktörünü 2.1.4.2 veya 2.1.4.3'te verilen formüllerde 'O' ve 'D' olarak kullanın.
- Burada açıklanan 4 türü kullanıyorsanız, hücreleri eşdeğer koloni oluşturan birim (CFU) / ml yoğunluklarına (daha önce Newell ve Douglas, Appl Environ Microbiol'de belirlenen OD 600'den CFU'ya dönüşüm) normalleştirin. (2014)) bu denklemi kullanarak:
E = ((OB) x V x D)/C
burada E = peleti yeniden süspanse etmek için hacim (μl), O = OD600 bakteri, B = OD600 boş ortam, D = katlama seyreltme, santrifüjlemeden önce V = μl bakteri kültürü, C = OD600 önceden belirlenmiş sabit. Bu denklemleri kullanan hesaplama örnekleri için Ek Kod Dosyası'na bakın. Otomatik olarak boşalan spektrofotometreler için "O-B" yerine "O" kullanın.
NOT: Önceden belirlenmiş sabitler (birimler OD600, 107 CFU ml-1'e normalleştirilmiş, Newell ve Douglas, Appl Environ Microbiol'de türetilen sabitler. (2014)) şu şekildedir: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
- Diğer bakteri türlerini kullanıyorsanız (CFU/OD600 sabiti mevcut değildir), şu denklemi kullanarak yoğunluğu OD600 = 0.1'e normalleştirin:
E = ((OB) x V x D)/0.1 OD600
NOT: Birimler adım 2.1.4.2'deki ile aynıdır. Bu denklemleri kullanan hesaplama örnekleri için Ek Kod Dosyası'na bakın.
- Biyogüvenlik kabininde, süpernatanı bir pipet ucuyla çıkarın ve peleti adım 2.1.4.2'de hesaplandığı gibi taze mMRS veya PBS'de yeniden süspanse edin.
- Bakterileri Aşılayın
- Bakterilerin 50 μl'si steril diyet ve biyogüvenlik kabininde yumurtaları dekoryonla konik tüplere aktarın. Şişeler arasında kontaminasyonu önlemek için yumurta transferinden sonra bakteri ekleyin.
- Aşılanmış tüpleri 25 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.
3. CFU Yükünü Ölçün/Sterilite Testi
- Tüm vücut sinek homojenatlarındaki CFU yükünü ölçmek için, 5 sineği (eklosyondan 5-7 gün sonra) 125 μl seramik boncuk ve 125 μl mMRS suyu içeren 1.7 ml'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Sinekleri bir doku homojenizatörü kullanarak 30 saniye boyunca 4,0 M/sn'de homojenize edin.
- Alternatif olarak, boncukları atlayın ve plastik tokmaklı mikrosantrifüj tüplerinde 1 dakika boyunca elle homojenize edin.
- Bağırsak mikrobiyotasını ölçüyorsanız, dışsal mikropları uzaklaştırmak için sinekleri yüzey sterilize edin. Sinekleri 1 dakika boyunca 100 μl% 70 etanol içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, etanolü aspire edin ve homojenizasyonlar için yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bağırsağın DNA içeriği ölçülecekse, etanol yıkamadan önce% 0.6 sodyum hipoklorit ile 1 dakika durulayın.
- Homojenatı 875 μl mMRS ile seyreltin, 5 saniye girdap yapın ve 120 μl homojenatı bir mikrotitre plakasının ilk oyuğuna pipetleyin.
- Sonraki iki kuyucukta 10 μl homojenat ve 70 μl MRS kullanarak iki ardışık 1:8 seyreltme gerçekleştirin.
- Birinci kuyucuktan 10 μl çıkarın ve 70 μl MRS içeren ikinci kuyucuğa ekleyin. İkinci kuyucuğun içeriğini iyice karıştırın, ikinci kuyucuktan 10 μl'yi 70 μl MRS içeren üçüncü kuyucuğa aktarın ve iyice karıştırın. Bu, orijinal 1.000 μl homojenatın toplam 3 konsantrasyonuna yol açar: seyreltilmemiş, 1:8 ve 1:64.
- Her seyreltmenin 10 μl'sini bir mMRS plakasına aktarın (istenirse çok kanallı bir pipet kullanarak). Seyreltmeyi agar yüzeyinden birkaç milimetre aşağıya yaymak için kabı hafifçe eğin ve plakayı hareket ettirmeden önce sıvının kurumasını bekleyin. Plakalar 2 günlükse sıvı plaka üzerinde hızlı bir şekilde kurur ve iki komşu damlacığın karışmasını azaltır.
- 30 °C'de 1-2 gün inkübe edin. Plakaları inkübatörden bir kez ayrıldıktan sonra çıkarın, tek tek koloniler görünür hale gelir ve 10-100 izole koloni ile bir seyreltmeden sayın.
- E = C x D/P x V/F denklemini kullanarak sinek başına CFU'yu hesaplayın, burada E = sinek başına CFU, C = sayılan koloni sayısı, D = seyreltme, P = μl kaplama, V = sinek homojenat hacmi ve F = homojenize edilmiş sinek sayısı.