$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol Guan ve ark., Yetişkin Kütikülü Boyunca Drosophila Bacak Motor Nöron Aksonlarını Görselleştirin, J. Vis. Uzm.(2018).
1. Bacak Diseksiyonu ve Fiksasyonu
- Çok kuyulu bir cam plaka alın ve uygun sayıda kuyuyu% 70 etanol ile doldurun. Her bir oyuğa 15-20 CO2-anestezi uygulanmış sinek (her cinsiyetten ve her yaştan) ekleyin ve bir fırça kullanarak, sinekler tamamen suya batırılana kadar sinekleri etanol çözeltisine hafifçe batırın.
NOT: Bu adım, kütikülün hidrofobikliğini ortadan kaldırmaktır. 1 dakikadan fazla yıkamayın, çünkü bu, kütikülün otomatik floresansını artırır.
- Sinekleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.3 noniyonik yüzey aktif madde deterjan çözeltisi ile 3 kez durulayın. Sinekleri bu solüsyonda en az 10 dk.
tutun
NOT: Deterjan dahil edildiğinde bacaklar daha iyi sabitlenir, bu da fiksatifin bacak içine nüfuz etmesini artırması muhtemeldir.
- %4 paraformaldehit (PFA) tüpü ile birlikte buzun üzerine çok kuyulu bir plaka yerleştirin.
NOT: %16 PFA etanol içermeyen bir stok çözeltisinden taze %4 PFA'nın hazırlanması kritik öneme sahiptir.
- Torasik segmente veya bacaklara zarar vermeden sineklerin başını ve karnını çıkarmak için forseps kullanın.
NOT: Karnın çıkarılması, sineği tutmayı ve bacakları incelemeyi kolaylaştırır.
- Bacakları torasik segmentten forseps ile inceleyin ve% 4 PFA içeren kuyucuklara yerleştirin. Bunun için, bacak ayrılana kadar ince forsepsin ucunu kullanarak koksa-toraks bileşkesine hafifçe ama sıkıca itin.
- Bacakları gece boyunca 4 ° C'de (toplamda yaklaşık 20 saat) %4 PFA'da sabitleyin.
- Bacakları %0,3 noniyonik yüzey aktif madde deterjan solüsyonu ile 1x PBS'de, 5x'te her biri 20 dakika yıkayın.
- Yıkama tamponunu montaj ortamıyla değiştirin. Bacağın içine tam olarak nüfuz etmesini sağlamak için bacağı montajdan önce en az bir gün montaj ortamında tutun.
NOT: Montaj ortamı oldukça viskoz ise, montaj ortamını 1x PBS ile %80'e kadar seyreltin çünkü viskozitedeki ani değişiklik kütikülün çökmesine ve bacağın genel yapısına zarar vermesine neden olabilir. Gal4 sürücüsüne bağlı olarak, sinekler montaja kadar montaj ortamında 4 °C'de 1 ila 3 hafta boyunca korunabilir.
2. Ayak Montajı
- Bir mikroskop lamının sol tarafına yaklaşık 20 μL %70 gliserol yerleştirin ve kare 22 x 22 mm2 lamel ile örtün (Şekil 1A,B). Bu lamelanın sağ kenarına paralel ve ondan küçük bir mesafede bir çizgi boyunca yaklaşık 10 μL montaj ortamı pipetleyin. Sürgünün sağ tarafına 30 μL daha fazla montaj ortamı ekleyin (Şekil 1C).
NOT: Bacakların üzerine bir lamel uygularken (aşağıya bakın), montaj ortamı, lamel altına ve bacakların etrafına, onları yerinden çıkarmadan nazikçe yayılacaktır.
- İnce forseps kullanarak bacağı solüsyondan kaldırın ve yavaşça sol lamel yakınındaki montaj ortamına koyun. Her bacak için aynısını yapın ve yukarıdan aşağıya hizalayın (Şekil 1D).
- Bacakları, forsepsin her iki ucu arasında tutulan bir damla ortamda kaldırın ve aktarın. Bacakları iki şekilde yönlendirin: dış taraf yukarı veya aşağı.
- Tüm bacaklar (en fazla 6-8 bacak monte edilebilir) düzgün bir şekilde hizalandıktan sonra, lamel ile doku arasında boşluk bırakmak ve bacakların hasar görmesini önlemek için bu lamel daha önce yerleştirilmiş lamel üzerine hafifçe dayanacak şekilde bacakların üzerine ikinci bir lamel koyun Şekil 1E (Şekil 1G).
NOT: Alternatif olarak, lamel ile slayt arasında boşluk oluşturmak için çıkartma kuyuları veya ortodontik balmumu kullanın.
- Lamellerin her köşedeki konumunu sabitlemek için bir oje kullanın (Şekil 1F).
NOT: Doku artık görüntülenmeye hazırdır.
