Bu protokol Radford ve McKim, Sabit Drosophila Oositlerinde Mayoz I'in Prometafazını ve Metafazını Görüntüleme Teknikleri, J. Vis. Exp. (2016).
NOT: Aksi belirtilmedikçe işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Sıcaklık kontrollü inkübatörler, aksi belirtilmedikçe sinek yetiştirme ve melezleme için sıcaklıkları korumak için kullanılır.
1. Hazırlıklar
- Sinekleri hazırlayın.
- Prometafaz ile zenginleştirilmiş oosit koleksiyonları.
- Sağlıklı, genç stoklardan veya çapraz kültürlerden temiz yetişkin sinekler. Şişeleri 25 °C.
sıcaklıkta iki gün yaşlandırın
NOT: Genel olarak, iki sağlıklı şişe yeterli olacaktır, ancak bazı çapraz kültürler için daha fazlasına ihtiyaç duyulabilir.
- İki gün sonra, şişelerden ~ 100 ila 300 dişi (bu noktada 0 ila 2 günlük olan) toplayın. Dişilerin bakire olmasına gerek yoktur. Bir şişenin yan tarafına bir parça maya macunu ekleyin ve mayalı şişelere 30 dişi ve 10 ila 15 erkek yerleştirin. Şişeleri 25 °C'de iki gün yaşlandırın.
- Metafaz ile zenginleştirilmiş Oosit Koleksiyonları.
- Stoktan veya çapraz kültürlerden ~ 100 ila 300 dişi toplayın. Bir şişenin yan tarafına bir miktar maya macunu ekleyin ve mayalı şişelere her biri 30 dişi (erkek eklenmeden) yerleştirin. Şişeleri 25 ° C'de üç ila beş gün yaşlandırın.
- Çözümleri Hazırlayın.
NOT: Çözeltiler, aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir.
- Modifiye Robb Tamponu Hazırlayın (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sükroz, 275 mM sodyum asetat, 200 mM potasyum asetat, 50 mM glikoz, 6 mM magnezyum klorür ve 5 mM kalsiyum klorür. PH'ı 7.4'e getirmek için 10 N 11:8 sodyum hidroksit: potasyum hidroksit kullanın. Filtrasyon ile sterilize edin; otoklav yapmayın. -20 °C'de saklayın. Oosit hazırlığı başına ~ 200 ml 1x Robb hazırlamak için gerektiği kadar çözdürün.
- Fiksasyon Çözümleri.
- Seçenek #1: Formaldehit/heptan fiksasyonu hazırlayın. Fiksasyon Tamponu Hazırlayın: 1x fosfat tamponlu salin (PBS) artı 150 mM sükroz. Kullanmak için, oosit hazırlığı başına 687,5 μl Fiksasyon Tamponu ve 312,5 μl %16 formaldehit ile taze yapın.
Dikkat: Çeker ocakta formaldehit solüsyonları kullanırken eldiven giyin. Atıkları kurumsal yönergelere göre atın.
- Seçenek #2: Formaldehit/kakodilat fiksasyonunu hazırlayın. Düzeltme Karışımını Hazırlayın: 250 mM sükroz, 100 mM potasyum asetat (pH 7.5), 25 mM sodyum asetat (pH 7.0) ve 25 mM EGTA (pH 8.0). Kullanmak için, oosit hazırlığı başına 400 μl Fix Mix, 100 μl potasyum kakodilat (1 M, pH 7.2) ve 500 μl %16 formaldehit ile taze yapın.
Dikkat: Potasyum kakodilat Arsenik içerir.
- PBS/Triton X-100'ü hazırlayın: 1x PBS artı %1 veya %0,05 Triton X-100. 4 °C'de saklayın.
- PBS-Tween 20-Sığır Serum Albümini (BSA) (PTB) hazırlayın: 1x PBS,% 0.5 BSA (a / h) ve% 0.1 Tween-20. 4 °C'de bir hafta saklanabilir.
2. Geç Dönem Drosophila Oositlerinin Toplanması
- Membranları sağlam olan Drosophila oositleri plastiğe ve cama yapışacağından, oosit hazırlığı başına 5 ml'lik bir tüpün ve bir Pasteur pipetinin içini PTB ile önceden kaplayın.
- Tüm ~ 100 ila 300 mayalı sinekleri karbondioksit ile uyuşturun ve ~ 100 ml 1x Robb Tamponu içeren bir karıştırıcıya ekleyin. Üç kez vurun (her biri ~1 saniye). Aktivasyonu önlemek için oositleri <20 dakika Robb'da tutun.
NOT: Alternatif olarak, oositler dişilerden elle disseke edilebilir. Bu yöntemin avantajı, daha az kadın gerektirmesidir. Bununla birlikte, hipoksi ile ilişkili artefaktları önlemek için karbondioksite maruz kalmayı sadece birkaç dakika ile sınırlamaya özen gösterilmelidir.
- Büyük vücut parçalarını çıkarmak için büyük ağdan (~ 1.500 μm) 250 ml'lik behere süzün. Ağ üzerinde çok sayıda sağlam karın kalırsa, ek Robb Tamponu kullanarak malzemeyi yeniden öğütün ve tekrar süzün. ~ 2 dakika dinlendirin, ardından mümkün olduğunca çok sayıda büyük vücut parçasını çıkararak üst tabakayı aspire edin.
- Küçük ağdan (~ 300 μm) 250 ml'lik bir behere süzün. Ek Robb ve kaplanmış Pasteur pipeti kullanarak ilk beherde kalan oositleri durulayın. ~ 3 dakika yerleşelim; Oositler yerleşir. ~ 10 ml hariç hepsini aspire edin.
- Kaplanmış 5 ml'lik tüpe sığacak kadar 10 ml'yi dökün. Çökelmesine izin verin, sıvıyı çıkarın ve kalanıyla tekrarlayın. Kalan oositleri ilave Robb ve kaplanmış Pasteur pipeti kullanarak beherden durulayın. 5 ml'lik tüpte ~3-5 dk bekletin.
3. İlaç Tedavileri (Opsiyonel)
- Her oosit hazırlığı için her 1 ml Robb'a uygun çözücü (kontrol) veya ilaç ekleyin. Her oosit hazırlığı için 1 ml Robb'a uygun çözücü (kontrol) veya ilaç ekleyin (Tablo 1).
- Oositleri ikinci kaplı 5 ml'lik tüpe bölün. Çökelmeye bırakın, sıvıyı çıkarın ve bir tüpe 1 ml Robb plus çözücü ve ikinci tüpe 1 ml Robb plus ilacı ekleyin. İlaç tedavisi için uygun süre boyunca nutat (Tablo 1). Yerleşelim.
4. Fiksasyon
- Tüm sıvıyı aspire edin ve hemen 1 ml Fix ekleyin.
- Seçenek #1: Formaldehit/heptan fiksasyonu (Fiksasyon Tamponu artı %5 formaldehit).
- Bir nutatör üzerinde 2,5 dakika sabitleyin. 1 ml heptan ekleyin ve 1 dakika girdap yapın. ~ 1 dakika yerleşmesine izin verin.
- Tüm sıvıyı çıkarın ve ardından 1 ml 1x PBS ekleyin. Girdap 30 sn. ~ 1 dakika yerleşmesine izin verin.
- Tüm sıvıyı çıkarın ve ardından tüpü 1x PBS.
ile doldurun
NOT: Oositler hemen kullanılabilir veya oda sıcaklığında birkaç saat nutatör üzerinde tutulabilir.
- Seçenek #2: Formaldehit/kakodilat fiksasyonu (Fix Mix artı %8 formaldehit ve 100 mM kakodilat).
- Bir nutatör üzerinde 6 dakika sabitleyin. 2 dakika dinlenelim. Sıvıyı çıkarın ve ardından tüpü 1x PBS.
ile doldurun
NOT: Oositler hemen kullanılabilir veya oda sıcaklığında birkaç saat nutatör üzerinde tutulabilir.
5. Membranların Çıkarılması ("Haddeleme")
- Kaplanmış Pasteur pipeti kullanarak, bir cam slaytın buzlu (kumlanmış) kısmına ~ 500 ila 1.000 oosit ekleyin. Forseps kullanarak tüm vücut parçalarını ve yabancı materyalleri çıkarın. Oositlerin kurumasına izin vermeyin; gerektiği gibi 1x PBS ekleyin.
- Oositlerin üzerine bir lamel yerleştirin ve tüm zarlar çıkarılana kadar oositleri nazikçe "yuvarlayın" (lamelin kenarını oositler boyunca sürüklemek en iyi sonucu verir). Mikroskop altında ilerlemeyi periyodik olarak kontrol edin, gerektiğinde daha fazla 1x PBS ekleyin. Çok fazla basınç yumurtaları tahrip edeceğinden dikkatli olun.
