$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Perkins ve Bickel'den bir alıntıdır, Prometafaz ve Metafaz I Drosophila Oositlerinde Kol Kohezyon Durumunu İzlemek için Floresan Yerinde Hibridizasyon (FISH) Kullanma, J. Vis. Exp. (2017).
1. Koryonların ve Vitellin Membranlarının Çıkarılması
NOT: Gerekli araçlar için Şekil 1'e bakın.
- Geç evre oositleri ayırın
- Sığ bir diseksiyon kabına 1 mL PBSBTx ekleyin. Sabit yumurtalıkları (~ 200 μL cinsinden) sığ tabağa aktarmak için BSA kaplı uçlu bir P150 kullanın. Olgun oositleri daha az olgun oositlerden çıkarmak için BSA kaplı pipet ucu ile yumurtalıkları yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Geç evre oositler yeterince ayrıldığında, tüm dokuyu 500 μL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Tüpte yaklaşık 150 - 200 μL bırakarak fazla sıvıyı çekilmiş bir Pasteur pipeti ile çıkarın. Kalan genotipler için bölüm 1.1'i tekrarlayın.
- Yuvarlanmaya hazırlanın
- Derin bir kuyu kabını 200 μL PBSBTx ile önceden ıslatın. Örtün ve bir kenara koyun. 3 buzlu cam slayt edinin ve slayt #3'ü bir kenara koyun. #1 ve #2 numaralı slaytların buzlu cam bölgelerini nazikçe ovalayın. Cam kırıklarını çıkarmak için deiyonize suda durulayın ve tek kullanımlık bir mendille kurulayın.
- #1 ve #2 numaralı slaytların buzlu bölgelerini, bir slayta 50 μL PBSBTx ekleyerek ve bu bölgeyi diğer slaytla ovalayarak PBSBTx ile kaplayın. Sıvıyı tek kullanımlık bir mendille çıkarın.
- Slaytları Şekil 2 A'da gösterilen konfigürasyonda bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Slayt #1 ve #2'nin buzlu bölgelerini, slayt #3 slayt #2'yi destekleyecek şekilde temas halinde tutun.
- Oositleri yuvarlayın; yuvarlanma yönünün her zaman düz bir çizgide olduğundan ve asla dairesel bir hareket olmadığından emin olun.
- Bir P200 pipet ucunu PBSBTx'te önceden ıslatın ve oositleri mikrofüj tüpünde yukarı ve aşağı pipetleyerek dağıtın. Oosit içeren 50 μL sıvıyı slayt #1'in buzlu cam kısmının ortasına aktarın. Bunu yapmak için slayt #2'yi kaldırın.
- Sıvının yüzey gerilimi iki buzlu cam bölgesi arasında bir sızdırmazlık oluşturana kadar slayt #2'yi yavaşça indirin. Buzlu alanı kaplayacak kadar sıvı olmalı, ancak hiçbiri dışarı sızmamalıdır. Sıvı taşarsa, fazla sıvıyı çıkarmak için çekilmiş bir Pasteur pipeti kullanın.
- Alt sürgüyü (# 1) bir elinizle yerinde tutun ve diğer elinizle üst sürgüyü (# 2) yatay yönde ileri geri hareket ettirmek için kullanın, slayt #2'yi düz tutun ve slayt #3'te desteklenin. Oosit hareketlerinin ve ilerlemesinin kolay görselleştirilmesi için mikroskop altında gerçekleştirin.
NOT: Bu hareket sürtünme yaratacak ve oositlerin "yuvarlanmasına" ve koryonlarını kaybetmesine neden olacaktır. Minimum basınç kullanılmalı, hareketler kısa ve hızlı olmalıdır.
- Yatay yönde birkaç hareketten sonra, hareket açısını hafifçe değiştirin (Şekil 2B). Çoklu artışlarla, üst sürgünün (# 2) hareketi başlangıç yönüne dik olana kadar bu açıyı kademeli olarak 90°'ye yükseltin (Şekil 2B). Sıvıda boş koryonların görüneceğini ve koryon eksikliği olan oositlerin daha uzun ve daha ince görüneceğini unutmayın.
- Çözelti hafif bulanıklaşana kadar 1.3.3 - 1.3.4 adımlarını yaklaşık 7 - 10 kez tekrarlayın. Oositlerin çoğunluğu (%75-85) vitellin membranlarını kaybetmiş gibi göründüğünde yuvarlanmayı bırakın.
NOT: Belirgin bir sivri uç genellikle vitellin membranları olmayan oositlerde görülür. Vitellin zarlarının çıkarılması koryonlara göre daha zordur. Vitellin membranlarının çıkarılmasını sağlamak için yuvarlanma sırasında üst kızağa (sürgü #2) hafif basınç uygulanabilir. Vitellin zarlarını tüm oositlerden çıkarmaya çalışmak genellikle diğer oositlerin tahrip olmasına neden olur.
- Üst sürgüyü (# 2) yavaşça kaldırın, köşelerinden birini alt sürgünün (# 1) buzlu bölgesinin ortasına sürükleyin, böylece haddelenmiş oositler buzlu bölgenin merkezinde birikir. PBSBTx ile her iki slayttaki oositleri PBSBTx içeren derin kuyu kabına durulayın.
- #1 ve #2 numaralı slaytları ultra saf suyla temizleyin, tek kullanımlık bir mendille kurulayın ve sıfırlayın. Aynı genotipteki tüm oositler yuvarlanana kadar 1.3.1 - 1.3.6 adımlarını tekrarlayın. Bu genellikle genotip başına 3-4 tur haddeleme gerektirir.
- Yuvarladıktan sonra kalıntıları temizleyin
- 15 mL'lik bir konik tüpe 1 mL PBSBTx ekleyin. Tüpün kenarlarını kaplamak için sıvıyı döndürün.
- PBSBTx kaplı bir P1000 pipet ucu kullanarak, haddelenmiş oositleri derin kuyu kabından 1 mL PBSBTx içeren konik tüpe aktarın. Oositleri içeren konik tüpe 2 mL daha PBSBTx ekleyin.
- Oositlerin dibe çökmeye başlamasına izin verin, ardından kalıntı içeren üst 2 mL çözeltiyi (chorions, vitellinler, vb.) bir P1000 ile çıkarın ve atın. Gerekirse, opak oositleri batarken görmek için konik tüpü koyu bir arka plana tutun.
- Oositlere 2 mL daha PBSBTx ekleyin ve adım 1.4.3'ü tekrarlayın. 1.4.3'ü tekrarlayın. toplam 3 tur enkaz kaldırma için.
- PBSBTx kaplı bir P1000 pipet ucu kullanarak, oositleri orijinal 500 μL'lik mikrofüj tüpüne geri aktarın. 20-25 dişi, yaklaşık 50 μL haddelenmiş olgun oosit vermelidir.
- Taze buzlu slaytlar, temiz bir derin kuyu kabı ve her genotip için yeni bir konik tüp kullanarak kalan genotipler için bölüm 4'ü tekrarlayın.
- Depolama gerekliyse, oositleri %0.1 TritionX-100 ile 1x PBS'ye aktarın ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın. Formaldehit çapraz bağlanması iyonik olmayan deterjanlar tarafından tersine çevrilebildiğinden uzun süreli depolama önerilmez.
