Kütikül Bozulması: Drosophila Larvalarından Hemolenf Toplamak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Reimels, T. A. ve Pfleger, C. M. Drosophila larvalarında lenf bezi ve hemositleri inceleme yöntemleri. J. Vis. Uzm. (2016).

Drosophila hemolenf, larva ve yetişkin aşamalarında vücutta dolaşan hem kan hem de interstisyel sıvı görevi görür. Bu video, dolaşımdaki hücreleri ölçmek için larva hemolenfini toplamak için bir protokolü açıklamaktadır.

Protokol

Bu protokol, Reimels ve Pfleger, Methods to Review the Lymph Bezi ve Hemositleri in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp.(2016).

1. Dolaşımdaki Hemosit Konsantrasyonu

1. Bu tahlil için kabaca aynı gelişim aşamasına sahip larvaları elde etmek için, dişilerin 2-6 saatlik sabit bir süre boyunca yumurta bırakmasına izin vererek yumurta toplamayı kısıtlayın.
2. Larvaları 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş diseksiyon kabı kuyularında toplayın.
3. Her larva için, 10 μl 1x PBS'yi buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpüne ve 10 μl 1x PBS'yi temiz bir diseksiyon pedine yerleştirin. Diseksiyon pedini aydınlatmalı bir stereomikroskop tabanına yerleştirin.
4. Tek bir larvayı, diseksiyon pedi üzerindeki bir PBS damlasına aktarmadan önce bir mendil mendili üzerine koyarak kurulayın.
5. Bir çift forseps kullanarak, hemolenfleri serbest bırakmak için kütikülü nazikçe yırtın ve dikkatlice ters çevirin.
   NOT: Kütikülü kazımamaya veya yumruklamamaya dikkat edin, çünkü bu potansiyel olarak sapsız hemositleri serbest bırakabilir.
6. Bir pipet kullanarak, hemolenfleri diseksiyon pedinden toplayın. Yağ gövdesi gibi larva kalıntılarını toplamaktan kaçının.
7. Hemolenfleri bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
   NOT: Aynı anda birkaç numune toplanabilir ve bir saate kadar buz üzerinde tutulabilir.
8. İsteğe bağlı: Ölü hücreleri boyamak ve çıkarmak için Tripan mavisini hemolenf numunesi ile eşit parçalar halinde karıştırın. Hücreler için toksik olduğu için Tripan mavisi ekledikten sonraki 3 dakika içinde hücreleri sayın.
9. Bir hemositometre odasına 10 μl yüklemeden önce numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
10. Otomatik hücre sayacı kullanıyorsanız, hücre boyutu ve dairesellik için uygun parametreleri ayarlayın. Örneğin, normal, yuvarlak hemositleri tespit etmek için minimum hücre boyutunu 2 μm, maksimum hücre boyutunu 22 μm ve %75 - 80 yuvarlaklık daireselliğini ayarlayın. Lamellositler gibi daha büyük ve iğ şeklindeki hemositleri tespit etmek için farklı parametrelerle deneyler yapın. Alternatif olarak, hemositleri manuel olarak saymak için bir hemositometre kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PBS tabletleri	MP Biyomedikal	2810305
diseksiyon tabağı	Corning	7220-85
mikrosantrifüj tüpü	Denville	C2170
Sylgard 184 kitinden yapılmış silikon diseksiyon pedi	Krayden (Fisher aracılığıyla dağıtıldı)	NC9644388 (Fisher katalog numarası)	Sylgard elastomer kitinin bileşenlerinin üretici talimatlarına göre karıştırılmasıyla petri kabında yapılır.
stereomikroskop	Morrell Instruments (Nikon distribütörü)	MNA42000, MMA36300	Nikon modelleri SMZ1000 ve SMZ645
Mendil silme	VWR (VWR)	82003-820
Forseps	Elektron Mikroskobu Bilimleri	72700-DZ
P200 Pipet	Eppendorf Belediyesi	3120000054
Kontes Otomatik Hücre Sayacı	Canlandırıcı	C10227
Kontes hücre sayma odası slaytları	Canlandırıcı	C10283
hemositometre	Hausser Bilimsel	3200
tripan mavi leke	Yaşam Teknolojileri	T10282

Serisi Serisi Serisi adet Serisi