Bu protokol, DeAngelis ve Johnson, İmmünohistokimya, Western Analizi ve RNA İzolasyonu için Drosophila Pupa Retina Diseksiyonu'ndan bir alıntıdır J. Vis. Uzm.(2019).
1. Doku Hazırlama
- İstenilen genotipin pupalarını elde etmek için Drosophila çaprazlamalarını (daha önce Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) veya kültüre özgü Drosophila suşlarını ayarlayın. Çok sayıda pupanın tesadüfen ortaya çıkmasını sağlamak için, bu sinek kültürlerini besin açısından zengin gıda ortamlarında veya cömertçe maya macunu ile desteklenmiş standart gıda ortamlarında iki kopya halinde oluşturun.
- Drosophila kültürlerini 25 °C'de muhafaza edin. UAS-GAL4 sistemini kullanan melezler için GMR-GAL4, morfogenetik karıkların arkasında ve pupa gelişimi boyunca larva göz diski hücrelerinde eksprese edilen ideal bir sürücüdür. Çapraz UAS-lacZ X GMR-GAL4, endojen olmayan ve inert β-galaktosidaz proteininin ekspresyonunu sağladığı için ideal bir kontrol çaprazı görevi görür.
- Damıtılmış su ile ıslatılmış 6" bambu atelinin ucunu kullanarak beyaz ön pupaları (Şekil 1B) sağlıklı kültür şişelerinin yanından nazikçe kaldırın (Şekil 1A) ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin (Şekil 1C).
- Pupaları kurumaya karşı korumak için hazneyi yeterli nemde tutmak için tüpleri damıtılmış suya batırılmış küçük bir doku parçasıyla birlikte plastik bir pipet ucu kutusuna yerleştirin (Şekil 1D). Pupaları diseksiyona kadar 25 ° C'de inkübe edin.
- Pupaları mikrosantrifüj tüpünden nazikçe dışarı ve siyah bir diseksiyon kabına itmek için kuru bir 6 "bambu atel kullanın. Pupalardan uzakta diseksiyon kabının üzerine yeni bir parça çift taraflı bant yerleştirin.
- Bir çift forseps kullanarak, pupa sırt tarafı yukarı bakacak şekilde (yani, operkulumlar yukarı bakacak şekilde, Şekil 1B) bandın üzerine dikkatlice yerleştirin (Şekil 2A). Pupaların banda iyi yapıştığından emin olun.
NOT: Pupa kılıfı üzerindeki nem, bandın güvenli bir şekilde yapışmasını engeller, bu durumda çift taraflı bant üzerine yerleştirmeden önce pupanın havada kurumasına izin verin.
2. Göz-beyin Komplekslerinin Diseksiyonu
- Her pupa'nın operkulumunu çıkarmak için forseps kullanın (Şekil 2C).
- Her bir pupanın pupa kılıfını dilimlemek veya kesmek için mikrodiseksiyon makası kullanın. Baş, göğüs kafesi ve ön karın segmentini ortaya çıkarmak için pupa kılıfını kanatla açın, pupa kılıfının kenarlarını çift taraflı banda sabitleyin (Şekil 2C).
NOT: Pupaları tamamen ortaya çıkarmak gerekli değildir.
- Hayvanı kavramak için her pupanın karnını keskin forsepslerle delin ve pupa kılıfından çıkarın (Şekil 2C).
- Pupaları banttan uzakta siyah diseksiyon kabına yerleştirin ve yaklaşık 400 μL buz gibi soğuk fosfat tamponlu çözelti (PBS, pH 7.4) ile kaplayın.
- Her bir pupayı forseps ile karnınızdan kavrayın ve mikrodiseksiyon makası ile tüm göğüs kafesi boyunca temiz bir kesit kesimi yapın ve pupayı ikiye bölün (Şekil 2D).
- Her karkasın arka kalıntısını PBS'den çıkarın ve diseksiyon kabının bir tarafına koyun (atmayın, bkz. adım 3.2.1).
- İki çift ince forseps kullanarak, göz-beyin kompleksini ortaya çıkarmak için her bir pupanın göğüs kafesini ve başını açın (Şekil 2E). Bunu yapmak için, toraks epitelinin kesik kenarlarını kavrayın ve toraksı ve ardından kafa kapsülünü açmak için yavaş yavaş yırtın, göz-beyin kompleksini ve çevresindeki yağ dokusunu açığa çıkarın.
- Dokuyu kavramadan, göz-beyin kompleksini kafa kapsülünün kalıntılarından uzaklaştırmak için forseps kullanın veya göz-beyin kompleksini yırtılmış açık kafa kapsülünden çıkarın.
NOT: Göz-beyin kompleksi dambıl şeklindedir, kirli beyazdır ve çevredeki krem renkli yağdan daha yarı saydamdır ( Şekil 2B,E).
- Forseps ile, göz dokusuna dokunmadan göz-beyin kompleksleri ile ilişkili yağların çoğunu dikkatlice çıkarın.
3. İmmünofloresan için Doku İşleme
- Tarif edildiği gibi en az 6-10 pupayı inceleyin (adım 2.1-2.9).
NOT: Her diseksiyonun üç ila dört bağımsız kopyası, bir hipotezi test etmek için yeterli veri sağlama eğilimindedir.
- Yıkama ve Fiksasyon
- P20 veya P100 pipet ucunun ucunu temiz bir tıraş bıçağıyla kesin ve uç açıklığını ~1 mm yarıçapa çıkarmak için açın ve PBS ve yağ karışımını yukarı ve aşağı pipetleyerek yağlayın. Bu yağ, adım 2.6'da çıkarılan karkas kalıntılarından elde edilebilir.
- Göz-beyin komplekslerini buz üzerinde 9 oyuklu bir cam tabakta ~ 400 μL PBS'ye aktarın. Aktarmak için yağlanmış ucu ve bir P20 veya P100 hava deplasmanlı mikropipeti kullanın.
NOT: Göz-beyin kompleksleri, pipetleme sırasında yağlanmamış uçlara yapışacak ve hasar görecek veya kaybolacaktır.
- Göz-beyin komplekslerini nazikçe döndürmek için PBS'yi yukarı ve aşağı pipetleyerek göz dokusuyla ilişkili kalan yağı çıkarın. Bu ve sonraki tüm yıkama adımlarında, hassas göz dokusuna zarar vereceği için göz-beyin komplekslerini doğrudan yukarı ve aşağı pipetlemeyin.
- Göz-beyin komplekslerini minimum hacimde (<20 μL) PBS'de en az 250 μL fiksatife aktarın. Solüsyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Buz üzerinde 35 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Adım 3.1.1'de hazırlanan aynı yağlanmış uç bu transfer için kullanılabilir.
- Aynı pipet ucuyla, göz-beyin komplekslerini ~ 400 μL PBS içeren bir kuyuya aktarın. Solüsyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve yıkamak için buz üzerinde 5-10 dakika inkübe edin. Yıkama adımını en az iki kez tekrarlayın.
NOT: Göz-beyin kompleksleri, Adım 3.3.1'e geçmeden önce son PBS yıkamasında, buz üzerinde veya 4 °C'de birkaç saat muhafaza edilebilir.
- Antikor Boyama
- Antikor çözeltilerine maruz kalmadan önce dokuyu bloke etmek için göz-beyin komplekslerini ~ 400 μL PBT'ye aktarın. Aktarım için yağlanmış ucu ve bir P20 veya P100 hava deplasmanlı mikropipeti kullanın. Buz üzerinde 10 ila 60 dakika inkübe edin.
- PBT'de uygun antikorları seyrelterek birincil antikor çözeltisini hazırlayın. Göz-beyin kompleksleri 10 μL'lik antikor çözeltisi içinde inkübe edildiğinden, hazırlanan hacim 10'un bir kopyası olacaktır.
- 10 μL antikor solüsyonunu 72 oyuklu bir mikro kuyu tepsisinin temiz bir kuyusuna alikot edin.
- P10 pipet ucunun ucunu temiz bir tıraş bıçağıyla kesin ve uç açıklığını ~0,5 mm yarıçapa çıkarmak için PBT'yi yukarı ve aşağı pipetleyerek yağlayın.
- <3 μL PBS'lik bir hacimde en fazla 5 göz-beyin kompleksini, bir P10 hava deplasmanlı mikropipet ve yağlanmış uç kullanarak her 10 μL'lik antikor çözeltisine aktarın.
- Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek antikor çözeltisini homojenize edin. Dokuya zarar vereceği için göz-beyin komplekslerini yukarı ve aşağı pipetlemeyin.
- Antikor çözeltisinin buharlaşmasını en aza indirmek için, damıtılmış suya batırılmış küçük bir doku parçasını mikro kuyu tepsisine yerleştirin ve tepsiyi kapatın (örneğin, sağlanan kapakla). Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Yıkamak için göz-beyin komplekslerini mikrokuyu tepsisinden 9 kuyulu bir cam tabakta ~ 400 μL PBT'ye aktarın. P10 hava deplasmanlı bir mikropipet ve PBT ile yağlanan uç kullanın (adım 3.3.4'te açıklandığı gibi hazırlayın). Solüsyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Buz üzerinde 5-10 dakika inkübe edin.
- Yıkama adımını en az iki kez tekrarlayın. Göz-beyin komplekslerini yıkama solüsyonları arasında aktarmak için bir P20 veya P100 hava deplasmanlı mikropipet ve PBT ile yağlanan uç kullanın.
- Uygun florofor etiketli ikincil antikorları PBT'de gerektiği gibi seyrelterek ikincil antikor çözeltisini hazırlayın. 6-10 pupa partisi başına 100 μL ikincil antikor çözeltisi yeterlidir. İkincil antikor solüsyonunu 9 kuyulu bir cam diseksiyon kabına alın.
- Göz-beyin komplekslerini ikincil antikor çözeltisine aktarın. Aktarım için bir P20 veya P100 hava deplasmanlı mikropipet ve PBT ile yağlanan uç kullanın.
- Göz-beyin komplekslerini ikincil antikor çözeltisi içinde oda sıcaklığında 1-2 saat veya 4 ° C'de 3-5 saat inkübe edin. Floroforların ışıkla ağartılmasını önlemek için, preparatı folyo ile kaplayın.
NOT: İkincil antikor çözeltisinde optimal inkübasyon süresi, kullanılan birincil ve ikincil antikorlara göre farklılık gösterebilir.
- Göz-beyin komplekslerini yıkamak için 9 oyuklu bir cam tabakta ~ 400 μL PBT'ye aktarın. Solüsyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Buz üzerinde 5-10 dakika inkübe edin. Bu yıkama işlemi en az iki kez tekrarlanmalıdır.
- İkincil Fiksasyon
- İkincil bir fiksasyon için, göz-beyin komplekslerini en az 200 μL fiksatife aktarın ve oda sıcaklığında 20 dakika veya 4 ° C'de 35 dakika inkübe edin.
NOT: İkincil fiksasyon göz dokusunu sertleştirir ve bu da montaja yardımcı olur (aşama 3.5).
- Göz-beyin komplekslerini 5 dakika boyunca yıkamak için buz üzerinde 9 oyuklu bir cam tabakta ~400 μL PBT'ye aktarmak için bir P20 veya P100 hava deplasmanlı mikropipet ve PBT ile yağlanmış uç kullanın.
- Yıkama adımını en az bir kez tekrarlayın.
- Göz-beyin komplekslerini 9 oyuklu bir cam tabakta, buz üzerinde ~ 400 μL PBS'ye aktarmak için bir P20 veya P100 hava deplasmanlı mikropipet ve PBT ile yağlanmış uç kullanın ve 1-2 dakika durulayın. PBS durulaması sırasında göz-beyin komplekslerinin çökelmesini ve cam tabağa yapışmasını önlemek için dokuyu yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu hareket halinde tutun.
- Montaj
- Göz-beyin komplekslerini ~200 μL montaj ortamına aktarın. Göz-beyin komplekslerini aktarmak için bir P20 veya P100 hava deplasmanlı mikropipet ve PBT ile yağlanan uç kullanın. Dokunun montaj ortamında 1-2 saat dengelenmesine izin verin.
- Temiz bir mikroskop lamı üzerine 5-8 μL'lik bir damla taze montaj ortamı yerleştirin.
- Uç açıklığını ~0,5 mm yarıçapa çıkarmak için temiz bir tıraş bıçağıyla bir P10 ucu kesin ve göz-beyin komplekslerini 5-8 μL montaj ortamı içinde slayt üzerindeki montaj ortamı damlasına aktarmak için bunu ve bir P10 hava deplasmanlı mikropipeti kullanın.
- Gözleri optik loblardan ayırmak için iki tungsten iğnesi kullanın. Sağlam bir tungsten iğnesi ile slayta bir göz-beyin kompleksi sabitleyin ve her bir gözü ince bir tungsten iğnesi ile ilişkili optik lobdan ayırın (Şekil 2F).
- Her bir gözün bazal yüzeyi slaydın bitişiğinde olacak şekilde her bir gözü mikroskop lamının yüzeyine manevra yapmak için ince tungsten iğnesini kullanın. Temiz bir örtü bezini mendil üzerine nazikçe indirin ve oje ile sabitleyin.
NOT: Slayt üzerindeki gözlerin birbirine yakın veya bir çizgi halinde olacak şekilde düzenlenmesi sonraki mikroskopi kolaylaştıracaktır.
- Floresan veya konfokal mikroskopi kullanarak retinaları görüntüleyin.
NOT: Slaytlar hemen görüntülenmezse 4 °C'de saklanmalıdır.
