Drosophila Geç Pupa İndirekt Uçuş Kası (IFM) Diseksiyonu: Yüksek Verimli Doku Toplama Yöntemi

Özet

Kaynak: Kao, S. Y., et al. Omik Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kaslarının Diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019).

Drosophila uçuş kasları, kas gelişimi ve fizyolojisi için model bir sistem olarak kullanılır. Bu video, yetişkinlerin uçuş kaslarını açıklar ve pupalardan RNA dizilimi için uygun olan dolaylı uçuş kaslarının geliştirilmesini incelemek için bir protokolü vurgular.

Protokol

Bu protokol, Kao ve ark., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscle for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. 48 saat APF'den sonra IFM Diseksiyonu

1. İki #5 biyoloji sınıfı forseps, ince makas, standart cam mikroskop slaytları, çift yapışkanlı bant, pipet, pipet uçları, kuru buz ve (RNA uygulamaları için) izolasyon reaktifi dahil olmak üzere gerekli ekipmanı birleştirin (bkz. 1x PBS ve mikrosantrifüj tüplerini buz üzerinde soğutun.
2. Hafifçe ıslatılmış bir boya fırçası kullanarak, aşamalı pupaları bir mikroskop lamı üzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bant şeridine aktarın (Şekil 1A). Pupaları aynı yönde yönlendirilmiş bir çizgiye yerleştirin (ventral aşağı ve slaytın altına doğru ön).
   NOT: Boya fırçası veya filtre üzerinde çok fazla su kullanmamaya dikkat edin, aksi takdirde pupa iyi yapışmaz. Pupa yapışmazsa, önce kuru bir filtreye veya kağıt mendile aktararak kurutun. 30 dakikalık bir zaman penceresi içinde disseke edilebilecek kadar çok pupa, ideal olarak ~ 10 pupa monte edin.
3. Pupa'yı pupa kılıfından çıkarın. Ön spiracles'ın üzerindeki pupa kılıfını ayırmak ve açmak için forseps kullanın (Şekil 1B).
4. Bir çift forseps yavaşça arkaya doğru dorsal olarak kaydırın ve forseps hareket ettikçe pupa kılıfını kesin (Şekil 1B'). Altta yatan pupayı yırtmamaya dikkat edin. Pupa'yı açılan kılıftan çıkarın ve hemen ikinci bir mikroskop lamı üzerinde 1x PBS'lik bir damlaya aktarın (Şekil 1B",C).
5. Hattaki tüm pupalar için 1.3 ve 1.4 adımlarını tekrarlayın, ardından çift yapışkanlı bant sürgüsünü bir kenara koyun.
6. İnce makas kullanarak, pupanın karnını göğüs kafesinden kesin ve ayrı bir yığın halinde itin (Şekil 1D,D'). Kalan pupa için tekrarlayın.
   NOT: Pupa bütünlüğü bozulur bozulmaz diseksiyon uzunluğunu adım 1.6 ile zamanlamaya başlayın. Hücre ölümünü ve buna bağlı transkriptomik ve proteomik değişiklikleri önlemek için 20-30 dakika içinde mümkün olduğunca çok sineği inceleyin. 1 günlük yetişkinleri veya >90 saatlik pupaları diseksiyon yaparken, daha sonraki adımlar için kafayı ince makasla ek olarak çıkarmak genellikle uygundur.
7. Bir kağıt mendil kullanarak, 1x PBS'nin çoğunu (genellikle asılı yağ ile bulanık) ve karın yığınını (Şekil 1E) çıkarın. Kalan göğüs kafeslerine bir damla taze, soğutulmuş 1x PBS ekleyin.
8. Göğüs kafesi ikiye kesmek için makası kullanın (Şekil 1F,F') tek bir hareketle baştan uzunlamasına vücut eksenini keserek. Alternatif olarak, kafa çıkarılmışsa, önce makası başın takıldığı yere yerleştirin ve toraksın üst yarısını IFM'ler arasında uzunlamasına kesin. Ardından, göğüs kafesinin ventral tarafını aynı yönde ikinci bir kesi ile kesin.
9. Tüm pupaların diseke edilmesi için 1.7 ve 1.8 adımlarını tekrarlayın ve slaydın merkezine yakın bir toraks hemiseksiyonu yığını oluşturun. Hemiseksiyonların kurumaması için slayt üzerinde yeterince soğutulmuş 1x PBS olduğundan emin olun.
   NOT: 48 saatlik APF'den sonra, IFM'ler standart bir diseksiyon mikroskobu altında eğitimli göz tarafından görülebilecek kadar büyüktür. Protokolün bu noktasında, floresan etiketli kaslar, IFM tanımlamasına yardımcı olmak veya eğitim amacıyla bir floresan diseksiyon kapsamına taşınabilir, ancak bu gerekli değildir.
10. IFM'leri torakstan disseke edin. #5 forseps (Şekil 1 G,H) kullanarak hemiseksiyonlardan birini izole edin. Bir forsepsin uçlarını yavaşça IFM'lerin ortasının üstüne ve altına yerleştirin (Şekil 1G',H'). İlk forsepsleri sabit tutarken, IFM'nin bir ucunu kütikül ve tendonlardan kesmek için ince makas kullanın. Ardından, IFM'nin diğer ucunu kütikülden serbest bırakın (Şekil 1G'',H'').
    NOT: İlk IFM kesiminden sonra göğüs kafesinin yönüne bağlı olarak, ikinci IFM kesiminin daha kolay gerçekleştirilmesi için göğüs kafesini 180° döndürmek faydalı olur.
11. IFM demetini forseps ile göğüs kafesinden çıkarın (Şekil 1G'',H'''), yerinde tutmak için su gerilimi kullanmak üzere PBS balonunun kenarına aktarın (Şekil 1I). Karkası sürgünün karşı tarafına itin. Kalan toraks hemiseksiyonları için tekrarlayın ve diseke IFM'lerin bir koleksiyonunu oluşturun.
    NOT: IFM'ler düzgün bir yığın halinde kalmazsa, 1x PBS'nin bir kısmını bir mendille çıkarın. Tüm PBS'nin buharlaşmasına izin vermemeye dikkat edin ve disseke edilen IFM'lerin ve hemitoraksların tamponla kaplı kaldığından emin olun.
12. Tüm IFM'leri inceledikten sonra, diseke edilen kas üzerinde hızlı bir şekilde kalite kontrolü yapın. #5 forseps kullanarak, numuneye girmiş olabilecek herhangi bir atlama kası veya kütikül parçasını çıkarın (Şekil 1J-K'').
    NOT: Sıçrama kası IFM'den farklı görünür. Mef2-Gal4 işaretli kasın floresan altında diseke edilmesi durumunda, sıçrama kası daha zayıf bir floresansa ve farklı bir şekil ve dokuya sahiptir. Normal ışık altında, IFM'ler opak, süt sarısı iken neredeyse yarı saydam görünür (Şekil 1J-J'',K).
13. Su gerilimi kullanarak, bir çift forseps (Şekil 1 L) arasında disseke edilmiş IFM'leri yakalayın (ancak ezmeyin). IFM'leri, 250 μL soğutulmuş 1x PBS (Şekil 1 M) ile önceden doldurulmuş 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hemen bölüm 2.
    ile devam edin NOT: Forseps uçları birbirine yaklaştırıldığında ve bir tampon çözeltisinden kaldırıldığında, su gerilimi forseps uçları arasında bir tampon kabarcığının yakalanmasına neden olur. Bu baloncuğun içinde IFM'ler de varsa, çözeltiden kaldırılabilir ve kolayca başka bir tampon dolu kaba aktarılabilirler. Tampon baloncuğunda yakalanan dokunun yumuşamasını önlemek için, uçları birbirine dokunmadan birbirine yaklaştırmak için forsepsleri sıkmak önemlidir.

2. IFM örneğini peletleyin ve koruyun

1. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü masa üstü bir santrifüjde 2.000 x g'da 3-5 dakika santrifüjleyerek IFM'leri peletleyin (Şekil 2A,B).
2. Bir pipet ucu kullanarak arabelleği çıkarın (Şekil 2C).
3. RNA uygulamaları için, IFM peletini istenen RNA izolasyon tamponunun 50-100 μL'sinde yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 2D). Aksi takdirde, adım 2.4.
   'ye geçin NOT: IFM'ler, kütle spektrometresi preparatları veya RNA'nın ticari kitlerle izolasyonu için adım 2.2'den sonra kuru dondurulabilir (temsili sonuçlara bakınız). RNA uygulamaları için, IFM peletinin izolasyon tamponunda hemen yeniden süspanse edilmesi ve dondurulmasıyla daha iyi sonuçlar elde edilir.
4. Numuneyi kuru buz üzerinde dondurun veya sıvı nitrojen içinde ani dondurun (Şekil 2E). Aşağı akış analizi için numune hazırlamanın sonraki adımlarına hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
   NOT: Kriyoprezervasyondan sonra, numuneler aşağı akış araştırması için işlenmeden önce birkaç ay saklanabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: 48 saat APF'den sonra IFM'lerin diseksiyonu. (A) Pupaların çift yapışkanlı bant üzerine hizalanması. (B) Pupa kılıfından önden açılarak, kılıf dorsaldan kesilerek (B') ve pupa kaldırılarak (B'') pupaların çıkarılması. Daire sembolleri Şekil 2 ile aynı şeyi temsil ediyordu. (C) Pupaların tampona aktarılması. (

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
60 mm kültür yemekleri	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Greiner tabaklar, 60 mm x 15 mM, havalandırmalı
Cep telefonu kamerası, Samsung Galaxy S9	Samsung Belediyesi	SM-G960F/DS	mikroskop altında çekilmeyen fotoğraflar için kullanılır
Çift yapışkanlı bant	İskoç/3M	3M Kimlik 70005108587	Çift taraflı bant, çoğu ofis malzemesi işleyicisinde bulunur
Dumont #5 Forseps	Güzel Bilim Araçları	11252-20	Inox düz uçlu 11 cm forseps, 0,05 mm x 0,02 mm uçlu Biyoloji sınıfı
floresan diseksiyon mikroskobu kamera, Leica DFC310 FX kamera	Leica Belediyesi		www.leica-microsystems.com
Floresan diseksiyon mikroskobu yazılımı, Leica Application Suite (LAS) sürüm 4.0.0	Leica Belediyesi		www.leica-microsystems.com
Floresan diseksiyon mikroskobu, Leica M165 FC	Leica Belediyesi		www.leica-microsystems.com
Uç: Bru1[M2]			Sinek stoğu; Bu kağıt
Uç: Bru1[M3]			Sinek stoğu; Bu kağıt
Uçmak: Mef2-GAL4	Bloomington Stok Merkezi	BDSC:27390 (İngilizce	Hisse senedi uçmak
Uçmak: salm[1]	Bloomington Stok Merkezi	3274	Hisse senedi uçmak
Uç: salm[FRT]			Sinek stoğu; bakınız Spletter ve diğerleri, Elife, 2018
Uç: UAS-Bru1IR	Viyana Drosophila Araştırma Merkezi	GD41568	Sinek stoğu, RNAi saç tokası
Uç: UAS-GFP::Gma	Bloomington Stok Merkezi	BDSC:31776	Hisse senedi uçmak
Uç: UAS-mCD8a::GFP	Bloomington Stok Merkezi	BDSC:5130	Hisse senedi uçmak
Uçmak: w[1118]	Bloomington Stok Merkezi	3605	Hisse senedi uçmak
Uç: weeP26			Sinek stoğu; bakınız Clyne et al., Genetics, 2003
GFP tespit reaktifi, GFP-Booster	ChromoTek	GBA488-100
glikojen	Canlandırıcı	10814-010
Görüntü işleme yazılımı, Photoshop CS6	kerpiç		www.adobe.com
İzopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Yöntem 1 (RNA izolasyonu): TRIzol	Yaşam Teknolojileri	15596018	Guanidinyum izotiyosiyanat ve fenol monofazik çözelti
Yöntem 2 (RNA izolasyonu): Yöntem 1 + TURBO DNA'sız Kit	Canlandırıcı	AM1907	TRIzol izolasyonu ve ardından DNA'yı çıkarmak için bir kit ile tedavi
Yöntem 3 (RNA izolasyonu): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kiti	Zymo Araştırma	R2070S Serisi	TRIzol'de RNA izolasyonu, ancak faz ayrımı kullanmak yerine ticari sütunlar üzerinden. Monarch DNase I Reaksiyon tamponunda Monarch Dnase I ile gerçekleştirilen önerilen DNaz tedavisi.
Yöntem 4 (RNA izolasyonu): RNeasy Plus Mini Kit	Keçi	74134	Sağlanan DNase tedavisini kullandık. IFM peletleri, hayvan dokuları için önerildiği gibi RTL tamponunda homojenize edildi.
Yöntem 5 (RNA izolasyonu): ReliaPrep RNA Doku Miniprep Sistemi	Promega	Z6110	'Fibröz Dokulardan RNA'nın Saflaştırılması' protokolünü uyguladık.
Yöntem 6 (RNA izolasyonu): Monarch Total RNA Miniprep Kiti	New England Biyolojik Laboratuvarları	T2010G	Doku/lökosit protokolü uygulandı ve 300 μL RNA Koruma Reaktifi içinde parçalandı.
Mikrosantrifüj tüpleri	Termo Balıkçı	AM12400	RNaz İçermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1.5 mL
Mikroskop slaytları	Termo Balıkçı	12342108	Standart slaytlar, şarjsız, 1 mm
Paintbrush	Marabu Belediyesi	1910000000	Marabu Fino Round No. 0 veya herhangi bir sanat kaynağından benzer bir fırça
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	158127
PBS arabelleği (1x)	Sigma-Aldrich	P4417 Serisi	1 L çözeltiler için fosfat tamponlu tuzlu su tabletleri, pH 7.4
PFA PureTip Pipet Uçları	Element Bilimi	ES-7000-0101	Numune kaybını azaltmak için standart pipet uçları yerine isteğe bağlı alternatif; 100 mL, 0,8 mm delik
Pipet uçları	Sigma-Aldrich	P5161 Serisi	Üniversal 200 mL pipet uçları
RNA konsantrasyonu Yaklaşımı 1 ve RNA bütünlük izleri, Biyoanalizör	Agilent Teknolojileri	G2939BA
RNA konsantrasyonu Yaklaşımı 2, Nanodrop	Termo Balıkçı	ND-2000
RNA konsantrasyonu Yaklaşım 3, Kübit 4 Florometre	Canlandırıcı	Q33238
RNase A	Promega	A7937
RNaz içermeyen su, Dietil pirokarbonat (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	DEPC, tüm RNase'i çıkarmak için suyu gece boyunca arıtın ve ardından otoklavlayın.
RT Kiti #1: Süper Senaryo III Ters Transkriptaz Kiti	Canlandırıcı	18080-044	Ters Transkripsiyon Kiti
RT Kiti #2: LunaScript	New England Biyolojik Laboratuvarları	E3010S Serisi	Ters Transkripsiyon Kiti
RT Kiti #3: QuantiNova Ters Transkripsiyon Kiti	Keçi	205410	Ters Transkripsiyon Kiti
İstatistiksel yazılım: GraphPad Prism	GraphPad Prizma		www.graphpad.com
İstatistiksel yazılım: Microscoft Excel	Microsoft Bilişim Sistemleri		Paketin bir parçası olarak satın alınanlar: Office Ev ve Öğrenci 2019
Masa üstü santrifüj	Eppendorf Belediyesi	5405000760	Eppendorf Santrifüj 5425 veya eşdeğeri
Mendil / Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Standart kağıt mendiller
Transfer pipeti	Sigma-Aldrich	Z350796	Plastik pipet
Vannas yaylı makas	Güzel Bilim Araçları	15000-00	3 mm kesme kenarı, uç çapı 0,05 mm, uzunluk 8 cm
Whatman kağıdı	Sigma-Aldrich	1004-070	Filtre kağıdı daireleri, Sınıf 4, 70 mm

Gazetesi Serisi ) Adet Serisi Gazetesi Serisi Serisi Fuar Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi (İngilizce) Fuar Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi arası Gazetesi