Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntülenmesi İçin Bir Yöntem

Bu protokol, Hancock ve ark., Drosophila melanogaster'de Öğrenme ile İndüklenen Sinaptik Plastisitenin İn Vivo Optik Kalsiyum Görüntülemesi, J. Vis. Uzm.(2019).

1. İn vivo kalsiyum görüntüleme

1. Titreşim yalıtımlı bir masaya monte edilmiş, kızılötesi lazer ve suya daldırma objektifi ile donatılmış bir çoklu foton mikroskobu kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). GFP tabanlı kalsiyum göstergelerinin görselleştirilmesi için lazeri 920 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ayarlayın ve bir GFP bant geçiren filtre takın.
2. Kaba Z ayar düğmesini kullanarak beynin Z eksenini tarayın ve ilgilenilen beyin bölgesini bulun. Tarama süresini en aza indirmek için taramayı yalnızca bu alana odaklamak ve tarama görünümünü başın ön kısmı aşağı bakacak şekilde döndürmek için kırpma işlevini kullanın.
3. Çerçeve boyutunu 512 x 512 piksele, tarama hızını > 4 Hz'ye ve tarama bölgesini (Y boyutunda) ilgilenilen nöronları kapsayacak şekilde ayarlayın.

2. Koku alma koşullandırması yoluyla koku ile uyarılan kalsiyum geçişlerinin görselleştirilmesi

1. Birkaç koku uyaranını zamansal olarak hassas bir şekilde iletebilen bir koku dağıtım sistemi kullanın.
   1. Cihazı kontrol etmek ve deneyler sırasında görüntü yakalama ile koku stimülasyonlarını koordine etmek için görüntüleme mikroskobu yazılımıyla iletişim kurmak için ek bir bilgisayar kullanın.
   2. Ayrı bir programda bir koku verme protokolünün başlatılmasıyla sağlanan harici bir giriş tetikleyicisine yanıt veren görüntü alma yazılımı ile koku dağıtım programını (örneğin, mikroskop kontrol yazılımına yüklenmiş bir VBA makro paketi, Malzeme Tablosuna bakın) bağlayabilen önceden programlanmış bir makro paketini başlatın.
2. 512 x 512 piksel çözünürlükte ve 4 Hz kare hızında "ön eğitim"/saf koku ile uyarılmış kalsiyum geçici akımlarını izleyerek ölçümü başlatın. Koku başlangıcından 6,25 s önce (F₀ referans değer oluşturmak için) ve koku ofsetinden 12,5 s sonra ek görüntü alımıyla desteklenen 2,5 s'lik bir koku uyaranı sağlayın. Bunu ikinci bir koku verici ile ve ardından üçüncü bir koku verici ile tekrarlayın.
3. Bu ölçümden 3 dakika sonra sineği klasik koşullandırma ("eğitim") ile devam edin.
   1. "Eğitim öncesi" aşamasında sunulan kokulardan birini CS⁺ kokusu olacak şekilde seçin ve diğerini CS kokusu olacak şekilde seçin. On iki adet 90 V elektrik şokunun yanı sıra 60 saniye boyunca bilgisayar kontrollü koku verme sistemini kullanarak CS⁺ kokusunu sunun.
   2. 60 sn aradan sonra, ^CS-kokusunu 60 sn boyunca tek başına sunun. Koku verici olarak 4-metilsikloheksanol ve 3-oktanol kullanın. Bu eğitim sırasında üçüncü koku vericiyi (örn. 1-okten-3-ol) sunmayın, çünkü bu yalnızca eğitim aşamasından önce (adım 2.2.) ve sonrasında (adım 2.4) kontrol olarak kullanılır.
4. Eğitim aşamasını bitirdikten 3 dakika sonra (adım 2.3) "eğitim öncesi" koku stimülasyon protokolünü (adım 2.2.) tekrarlayarak "eğitim sonrası" koku ile uyarılan kalsiyum geçişlerini tekrar ölçün.
   NOT: Bu adımın zamanlaması, hafıza oluşumundan sonraki ilgi süresini yansıtmalıdır (örneğin, kısa süreli hafızayı araştırmak için bu adımı koşullandırma adımından 3-4 dakika sonra gerçekleştirin). Tipik olarak, sinekler bu hazırlıkta birkaç saat hayatta kalabilir.
5. Görüntüleme dosyalarını daha sonra görüntü analizi için uygun bir formatta (ör. Tiff) kaydedin.