$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Gervaise ve Arur, C. elegans Germline'daki Aktif ERK'nin Mekansal ve Zamansal Analizi. J. Vis. Uzm.(2016).
1. Gonad elde etmek için yetişkin solucanların diseksiyonu
- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 100 μL M9 tamponunda istenen ve spesifik gelişim aşamasında (L1, L2, L3, L4, yetişkin, vb.) 100 - 150 WT (N2) veya istenen genotip solucanları seçin.
- Mikrosantrifüj tüpünü 900 μL M9 tamponu ile doldurun (Malzeme Tablosuna bakınız). Tüpleri ortam sıcaklığında 1,000 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde 1 x g'da santrifüjleyin.
- M9 tamponunun 900 μL'sini yavaşça çıkarın ve atın. Solucanların yanlışlıkla çıkarılmamasını sağlamak için tamponu diseksiyon mikroskobu altında çıkarın.
- 1.2 - 1.3 arasındaki adımları her seferinde yeni M9 arabelleği ile iki kez daha tekrarlayın. Bu, solucanlarla birlikte taşınan bakterilerin etkili bir şekilde yıkanmasını sağlar.
- Son yıkamadan sonra 900 μL M9 tamponunu tüpten çıkarın ve atın.
- 200 μL mikropipet ucu ile 100 - 150 solucan içeren kalan 100 μL M9 tamponunu düz tabanlı bir cam saat kabına aktarın. Kullanmadan önce mikropipet ucunun 10 μL işaretinde kesildiğinden emin olun. Ucun kesilmemesi solucanların kesilmesine neden olur.
- M9 tamponundaki solucanları içeren cam saat çanağına 1 - 3 μL 0,1 M levamisol ekleyin. Solucanlar hareket etmeyi bırakana kadar eşit şekilde karıştırmayı sağlamak için levamisol ve M9'u hafifçe döndürün.
NOT: Levamisol stokları uzun süreli depolama için -20 °C'de saklanabilir. Burada, hayvanlarda hızlı hareketlilik kaybı elde etmek için literatürde tarif edilenden 1 - 3 mM'lik daha yüksek konsantrasyon kullanın23 0.2 - 0.25 mM levamisol. Hayvanlar sıvı süspansiyon içinde çok uzun süre yüzerlerse, gonadlarda ortaya çıkan dpERK paternleri değişken olabilir (stres veya beslenme eksikliği veya her ikisi nedeniyle). Diseksiyon için 1-3 mM levamisol ile daha tekrarlanabilir boyama paternleri elde edilmiştir.
- İki adet 1 mL şırıngaya iki adet 25 G iğne takın (şırınganın boyutu önemli değildir, iğnenin ölçüsü kritiktir). Her iki elinize bir şırınga yerleştirin (Şekil 1).
- Diseksiyon mikroskobu altında, her bir iğneyi Şekil 1'de gösterildiği gibi her bir solucanın altına ve üzerine yerleştirin ve makas benzeri bir hareketle ikinci faringeal ampulün yanına solucan üzerine ince bir kesik yerleştirin. Solucanda bir kesimden sonra, tabaktaki tüm hayvanlar en az bir kez kesilene kadar bir sonraki hayvana geçin.
NOT: 1.8 - 1.9 arasındaki adımların zamana duyarlı olduğunu unutmayın. Tekrarlanabilir bir dpERK modeli için tabaktaki tüm solucanları beş dakikadan kısa sürede inceleyin. Daha uzun diseksiyon süreleri, özellikle Bölge 1'de dpERK sinyalinin kapanmasına neden olacaktır. Ayrılan zaman diliminde kalmak için gerekirse diseksiyon turu başına solucan sayısını ayarlayın (yani, 50 solucana karşı 150).
- Diseksiyon sırasında ekstrüde edilmiş bir gonad görünmüyorsa, aynı hayvanda başka bir kesim yapmaya çalışmayın. Genellikle bu sadece hayvanı keser ve gonadın ekstrüzyonu ile sonuçlanmaz. Bunun yerine, bir sonraki hayvana geçin. Gonadların dışarı çıkmadığı solucanlar, 6. bölümde yapılacak slaytlarda bu şekilde görünecek ve görüntüleme sırasında göz ardı edilebilecektir
NOT: Tüm diseksiyon ve işleme adımları boyunca, gonadın vücuda/karkasa bağlı kalacağını akılda tutmak önemlidir. Gonadı ve vücudu iğne ile birbirinden ayırmaya zorlamayın. Çoğu zaman, gonadı vücuttan koparmak amacıyla gonadal dokuda anormal bir yırtılma, sahte antikor sinyaline neden olabilir. Görüntüleme adımları sırasında vücut/karkas göz ardı edilebilir ve sadece gonad görüntülenir. Ek olarak, bazen bağırsak hücreleri, test edilen antikor için iç kontroller / somatik kontroller olarak da işlev görebilir.
Şekil 1: Diseksiyonlar sırasında İğne Pozisyonlarının gösterilmesi. Solda: Devam eden bir diseksiyonun fotoğrafı. Sağ: Solucana göre iğne pozisyonları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
