Tek Solucan PCR: Genomik DNA'yı Çıkarmak ve Çoğaltmak için Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Prior, H., et al. CRISPR/Cas9 Ribonükleoproteinleri Kullanarak C. elegans'ta Genomik Nokta Mutantları Oluşturmak İçin Hızlı ve Kolay Bir Boru Hattı.J. Vis. Uzm.(2018).

Bu videoda, PCR taraması ile tek bir nematodun genetik bir belirteç için hızlı bir şekilde taranması için kullanılan bir teknik açıklanmaktadır. Örnek protokolde, CRISPR tabanlı genom düzenlemeyi tarıyoruz.

Protokol

Aşağıdaki protokol, Prior ve ark., CRISPR/Cas9 Ribonükleoproteinleri Kullanarak C. elegans'ta Genomik Nokta Mutantları Oluşturmak için Hızlı ve Kolay Bir Boru Hattı, J. Vis. Exp. (2018).

Tek Solucan PCR ve Genotipleme

1. 1-2 günlük yumurtlamadan sonra, F_1'leribir solucan penası kullanarak 7 μL Solucan Lizis Tamponu içeren ayrı PCR şerit tüp kapaklarına aktarın (Tablo 1, Şekil 1D, gün 4 - 5).
2. Hayvanları tüpün dibine getirmek için PCR tüplerini oda sıcaklığında 1 dakika maksimum hızda santrifüjleyin ve tüpleri 1 h.
   için -80 ° C'de dondurun NOT: Solucanlar -80 °C'de süresiz olarak saklanabilir.
3. Dondurulmuş solucanları aşağıdaki programı kullanarak bir termodöngüleyicide parçalayın: 60 ° C'de 60 dakika, 95 ° C'de 15 dakika, 4 ° C'de tutun.
4. PCR mastermix'ini Tablo 2'de gösterildiği gibi ayarlayın.
5. Temiz PCR tüplerine 21 μL PCR mastermix ekleyin ve ardından 3. adımdan itibaren 4 μL solucan lizisi ekleyin. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın ve üreticinin yönergelerine göre PCR programını çalıştırın (Malzeme Tablosuna bakın).
6. Üretici talimatlarını izleyerek bir DNA Temizleme ve Konsantre kiti kullanarak PCR reaksiyonlarını saflaştırın (Malzeme Tablosuna bakın). Spin kolonuna 10 μL su ekleyerek DNA'yı elute edin.
7. Tablo 3'te gösterildiği gibi kurulum kısıtlama enzimi mastermix.
8. Temizlenmiş her PCR reaksiyonuna 10 μL restriksiyon enzimi mastermix ekleyin ve 37 °C'de 1-2 saat inkübe edin.
9. 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu kullanılarak 120 V'ta çalıştırılan %1,5'lik bir agaroz jel üzerinde ayrı sindirilmiş PCR ürünleri.

Sonuçlar

Şekil 1. C. eleganssod-1 lokusunun CRISPR-Cas9 mühendisliği. (A) C. elegans'taki sod-1 lokusunun ekson-intron yapısını gösteren şematik çizim. Kırmızı çubuk, G93'ün ekzon 3'teki konumunu gösterir. Astar çifti seti kırmızı oklarla (F1-R1) belirtilir. (B) İnsan ve C. elegans (solucan) SOD-1 proteinlerini...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nukel içermeyen su	Synthego Inc.	sgRNA kiti EZ kiti ile sağlanır
KCl	Sigma	P5405 Serisi
DNA Temizleme ve Yoğunlaştırıcı	Zymo Araştırma	D4004
Zymoclean Jel DNA Kurtarma Kiti	Zymo Araştırma	D4002
Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli 2X Master Mix	New England Biyolojik Laboratuvarları	M0494L
Proteinaz K	Sigma	P2308 Serisi
MgCl2	Sigma	M2393 Serisi
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Balıkçı Bilimsel	BP337-100
RNaseZap Dekontaminasyon Solüsyonu	Balıkçı Bilimsel	AM9780

Serisi Serisi Serisi Serisi