Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Abstract

Kaynak: Escorcia, W., et al. Caenorhabditis elegans’ta Lipid Bolluğunun Ölçülmesi ve Lipid Dağılımının Nil Kırmızısı ve Yağ Kırmızısı O Boyama ile Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, Nil Kırmızısı boyası kullanılarak lipitleri bütün, sabit solucanlar halinde boyamak için bir protokol açıklanmaktadır. Lipid damlacıklarının çekirdeğindeki nötr lipidleri spesifik olarak görüntülemek için, lekeli C. elegans’ın yeşil emisyon spektrumlarını görüntüleyin.

Protocol

Bu protokol, Escorcia ve ark., Nil Kırmızısı ve Yağ Kırmızısı O Boyama ile Caenorhabditis elegans’ta Lipid Bolluğunun Ölçülmesi ve Lipid Dağılımının Değerlendirilmesi, J. Vis. Exp. (2018).

1. Nil Kırmızısı (NR) Lipitlerin Boyanması

1. 5 mg / mL NR stok çözeltisinin hazırlanması
   1. 500 mL’lik bir şişede, 200 mL %100 asetona 100 mg NR tozu ekleyin.
   2. Işığa maruz kalmamak için şişeyi alüminyum folyo ile örtün.
   3. Kullanmadan önce, çözeltiyi karanlıkta 2 saat karıştırın.
   4. Uzun süreli kullanım için, NR stok çözeltisini herhangi bir ışığa maruz kalmadan sıkıca kapatılmış bir şişede saklayın. NR stok çözümünü araştırma ihtiyaçlarına göre ölçeklendirin. Tutarlı boyama ve görüntüleme sonuçları elde etmek için NR boyama deneylerinde aynı stok çözeltisinin kullanıldığından emin olun.
2. NR çalışma çözümünün hazırlanması
   1. Her 1 mL %40 izopropanol (h/h) için 6 μL NR stok çözeltisi ekleyin.
   2. Her numune için 600 μL NR çalışma solüsyonu hazırlayın.
      NOT: Boyamadan hemen önce taze NR çalışma solüsyonu yapın. NR stok çözeltisi ihtiyaçlarına bağlı olarak, 15 mL veya 50 mL dereceli konik boru kullanın.
3. NR lipid boyaması için solucanların hazırlanması
   1. Geç log OP50 E. coli ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde 20 ° C’de erken L4 aşamasına kadar solucanlar büyütün.
   2. Solucanları plakadan 1 mL 1x fosfat tamponlu salin +% 0.01 Triton X-100 (PBST) çözeltisi ile yıkayın ve solucan süspansiyonunu 1.5 mL’lik bir mikrofüj tüpüne koyun.
   3. Solucanları 560 x g’da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve E. coli süspansiyondan temizlenene kadar bu adımı tekrarlayın.
   4. Solucan peletine 100 μL %40 izopropanol ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
   5. Solucanları 560 x g’da 1 dakika santrifüjleyin ve solucan peletini bozmadan süpernatanı çıkarın.
      NOT: Daha büyük plakalar kullanıyorsanız veya plaka başına daha fazla solucan boyuyorsanız, solucanları plakalardan yıkamak için daha yüksek hacimlerde PBST kullanın. Numune fiksasyonundan 15 dakikadan fazla önce solucanları PBST’de yıkamayın. Süpernatan bakterilerden arındırılmamışsa ek yıkamalar yapın. İnkübasyonu, bir nutatör veya külbütör kullanarak% 40 izopropanol içinde gerçekleştirin. Tam numune ajitasyonunun meydana geldiğinden emin olmak için her zaman tüpleri izleyin.
4. NR ile lipit boyama
   1. Karanlıkta, her numuneye 600 μL NR çalışma solüsyonu ekleyin. Tüpleri üç kez ters çevirin ve solucanları NR çözeltisinde tamamen karıştırın.
   2. Numuneyi karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat döndürün.
   3. Kuluçkadan sonra, solucanları 560 x g’da 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   4. 600 μL PBST ekleyin ve fazla NR lekesini çıkarmak için numuneleri karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
   5. Numuneleri 560 x g’da 1 dakika santrifüjleyin ve yaklaşık 50 μL süpernatant.
      hariç hepsini çıkarın NOT: NR inkübasyonu ajitasyon gerektirmez. Bu adımda solucanların yerleşmesi yaygındır.
5. Mikroskop görüntüleme için slaytların hazırlanması
   1. Kalan süpernatantta solucan peletini yeniden askıya alın.
   2. Bir mikroskop lamına 5 μL sonsuz süspansiyon yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı sıkışmasını önlemek için dikkatlice bir lamel koyun.
   3. Solucanları görüntülemeden önce lameli oje ile kapatın.
   4. Bir seferde yalnızca birkaç slayt hazırlayın. Bu, NR görüntülemenin numuneler arasında sabit kalmasını sağlayacaktır. NR lekeli görüntülerin kalitesi 6 saat sonra düşer. Ayrık lipid damlacıklarının gözlemlenmesi zordur ve arka plan floresansı artar, bu da NR sinyalinin algılanmasını engeller.
6. NR lekeli solucanların görüntülenmesi
   1. Görüş alanı başına birkaç hayvanı yakalamak için solucanları 5X büyütmede görüntüleyin.
   2. Tek tek solucanların daha iyi ölçülmesi için 10X büyütmeye geçin.
   3. NR lekeli solucanları görüntülemek için FITC/GFP kanalını kullanın ve miktar tayini için en uygun koşulları belirlemek için farklı maruz kalma sürelerini deneyin.
   4. Sıkıştırma nedeniyle veri kaybını önlemek için dosyaları TIF formatında kaydedin.
      NOT: Tipik maruz kalma süreleri 100-1000 ms arasında değişir. Optimum maruz kalma süresine sahip olarak, görüntüleme tutarlılığını korumak için tüm numuneler için kullanın.

Materials

Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator