$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Almanya ve ark. Yuvarlak Kurt Caenorhabditis elegans'tan Belirli Nöron Popülasyonlarının İzolasyonu, J. Vis. Uzm.(2019).
1. Hücre izolasyonu için yaşlanmış solucanların hazırlanması ve toplanması
NOT: Aşağıda, Minnesota Üniversitesi'ndeki Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) suş deposundan elde edilen transgenik unc-17::GFP suşundan (OH13083) kolinerjik nöronların izolasyonu açıklanmıştır. Mantar veya bakterilerden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için steril koşulların sürdürülmesi zorunludur.
- T. Stiernagle tarafından tarif edildiği gibi ağartma yöntemiyle solucanları hazırlayın ve senkronize edin. Yaşlanma deneyleri için, yumurta üretimini azaltmak ve yumurta çatlamasını durdurmak için 25 μM su florodeoksiüridin (FuDR) çözeltisi içeren nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları üzerine plaka kurtları. Güvenilmez sonuçlara neden olacağından, kontaminasyonu veya yumurtanın çatlamasını önlemek için agar plakalarını düzenli olarak inceleyin.
NOT: unc-17::GFP hücreleri için, yeterli miktarda ilgili hücreyi izole etmek için tipik olarak üç adet 100 mm x 15 mm NGM plakası kullanılır.
- Solucanları toplayın ve hücre izolasyonu için tamponlar hazırlayın.
- Solucanları 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Solucanları plakadan 1.5 mL M9 tamponu (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7.0) ile yıkayın ve 1.600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve solucanları 1 mL M9 tamponu ile yıkayın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve mümkün olduğunca fazla E. coli kontaminasyonunu gidermek için toplam beş kez yıkayın.
NOT: Bu adımda ampisilin gibi antibiyotiklerin (50 μg/mL) eklenmesi bakteriyel kontaminasyonu azaltmaya yardımcı olabilir.
- İki numune için 2 mL sodyum dodesil sülfat-ditiyotreitol (SDS-DTT) lizis tamponu hazırlayın: 200 mM DTT, %0.25 (a/h) SDS, 20 mM HEPES (pH 8.0) ve %3 (a/h) sakaroz.
- 15 mL izolasyon tamponu (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7.3]) hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
NOT: Hem SDS-DTT lizis tamponu hem de izolasyon tamponu her deneyden önce taze hale getirilmelidir.
- Kütikül bozulması ve tek hücre izolasyonu
- Adım 1.2.1'de toplanan hayvanları 5 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjleyin. Tüm süpernatanı çıkarın ve solucanları 1 mL M9 ortamında askıya alın ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 5 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjleme ile pelet solucanları.
- Solucanlara 200 μL SDS-DTT lizis tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin. Solucanlar, ışık mikroskobu altında bakıldığında vücut boyunca "göz kırpılmış" gibi görünmelidir.
NOT: SDS-DTT lizis tamponuna uzun süre maruz kalmak, solucanların ölümüne neden olabilir ve bu da solucanlar gözlemlenerek izlenebilir. Ölü olan solucanlar uzar ve kıvrılmaz.
- 800 μL buz gibi soğuk izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü hafifçe vurarak karıştırın.
- Pelet kurtlarını 4 ° C'de 13.000 x g'da 1 dakika boyunca çıkarın, süpernatanı çıkarın ve 1 mL izolasyon tamponu ile yıkayın.
- Adım 1.3.5'i toplam beş kez tekrarlayın ve her seferinde izolasyon arabelleğini dikkatli bir şekilde çıkarın.
- İzolasyon tamponunda çözülmüş Streptomyces griseus'tan (15 mg/mL) (Malzeme Tablosu) 100 μL proteaz karışımını pelete ekleyin ve RT.
'de 10-15 dakika inkübe edin
NOT: SDS-DTT lizis tamponunda olduğu gibi, genişletilmiş proteaz sindirimi, plazma zarı boyunca proteinlerin aşırı bölünmesine neden olabilir ve yüzeye maruz kalan GFP'nin manyetik boncuklar yoluyla izolasyonunu önleyebilir.
- Proteaz karışımı ile inkübasyon sırasında, numuneleri 1.5 μL'lik mikropipet ucu ile 200 μL'lik mikrosantrifüj tüpünün dibine ~60-70 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik bozulma uygulayın. Hücreleri düzgün bir şekilde ayırmak için pipet ucunu mikrosantrifüj tüpünün duvarına sabit basınçla tutun.
- Sindirim aşamasını belirlemek için, sindirim karışımından küçük bir hacim (~1−5 μL) çıkarın, bir cam lam üzerine bırakın ve bir doku kültürü mikroskobu kullanarak inceleyin. 5-7 dakikalık inkübasyondan sonra, solucan parçaları gözle görülür şekilde azaltılmış kütiküle sahip olmalı ve bir hücre bulamacı kolayca görülebilecektir.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin (50 U / mL penisilin ve 50 μg / mL streptomisin'de nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş, ticari olarak temin edilebilen 900 μL soğuk Leibovitz'in L-15 ortamı ile reaksiyonu durdurun.
- Pelet izole edilmiş fragmanları ve hücreleri, 4 ° C'de 10.000 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile izole edin. Fazla kalıntı ve kütikülün çıkarıldığından emin olmak için peletlenmiş hücreleri 1 mL soğuk L-15 takviyeli ortamla iki kez daha yıkayın.
- Peletlenmiş hücreleri 1 mL L-15 takviyeli ortamda yeniden süspanse edin ve 30 dakika buz üzerinde bırakın. Yaklaşık 700−800 μL olan üst tabakayı bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Bu katman, hücre kalıntısı olmayan hücreleri içerir ve ilgilenilen hücrelerin sonraki izolasyonunda kullanılacaktır.
- Üreticinin talimatlarına göre, 10-25 μL izole hücrelerin hücre yoğunluğunu ölçmek için otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanın.