Etanol Fiksasyonu ve DAPI Boyama: C. elegans'ta DNA'yı Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Clarke, E. K., et al. Caenorhabditis elegans'ta Ploidi Manipülasyonu. J. Vis. Uzm. (2018).

Burada, sabit, bozulmamış nematodlarda genomik DNA'yı görselleştirmek için kullanılan bir tekniği açıklıyoruz. Video, döllenmemiş C. elegans oositlerindeki kromatini saymak için örnek bir protokol içerir.

Protokol

Bu protokol, Clarke ve ark. Caenorhabditis elegans'ta Ploidi Manipülasyonu, J. Vis. Exp. (2018).

Tetraploid suşları, döllenmemiş oositlerindeki kromozom sayısı sayılarak doğrulanabilir. Floresan mikroskobu, suşun kromozomlar için bir floresan işaretleyicisi varsa, döllenmemiş diploid oositlerde (mayotik bölünmelerden önce) kromozom çiftlerinin sayısını taramak için kullanılabilir. Floresan kromozom belirteçlerinin yokluğunda, tetraploid nematodlar, nematodların sabitlenmesi ve bir DNA boyası ile boyanması yoluyla taranabilir; etanol sabitleme ve bütün hayvan 4 ",6-Diamidin-2" -fenilindol dihidroklorür (DAPI) boyama için bir protokol için aşağıya bakınız.

Bütün hayvan DAPI boyama

NOT: 12 bağlı kromozom çifti taşıyan tetraploid suşlar, DAPI'nin bu hayvanları boyaması ve döllenmemiş oositlerindeki DAPI cisimlerinin sayısını saymasıyla doğrulanabilir.

1. Bir mikroskop lamı üzerine 5 ila 10 μL M9 tamponu yerleştirin, ardından damlaya 6-10 nematod aktarın.
2. Diseksiyon mikroskobu altında, nematodları tüy bırakmayan bir temizleme dokusu ile çıkarmadan M9'un çoğunu damladan çekin. Ardından, solucanların üzerine hemen 10 μL'lik bir damla %90 etanol ekleyin. Solucanların tamamen kurumasına izin verin, ancak birkaç saniyeden daha uzun süre değil.
3. Etanol buharlaşır buharlaşmaz (bu, diseksiyon mikroskobu altında olduğu gibi görülebilir), solucanların üzerine 10 μL daha %90 etanol ekleyin.
4. Adım 3.1.3'ü üç kez daha tekrarlayın.
5. Etanolün son damlası buharlaştıktan sonra, tercih edilen montaj ortamında önerilen nihai konsantrasyonda 6 μL DAPI veya Hoechst boyası ekleyin (örneğin, M9'da 2 ng / μL DAPI stok konsantrasyonunun 1: 1.000 seyreltilmesi). Slaytların uzun süreli saklanması için, sadece M9 yerine bir antifade çözeltisi olarak 20 mM Tris-HCl, pH 8.8 içinde% 90 gliserol içinde çözülmüş% 0.5 p-fenilendiamin kullanılabilir.
6. Lamel üzerindeki solucanları bir lamel ile örtün ve lamel kenarlarını oje ile kapatın. Lameli ekledikten en az 10 dakika sonra bir floresan mikroskobunda (adım 3.1.7) puan alın. Antifade içermeyen slaytlar, puanlamadan önce 4 ° C'de birkaç gün saklanabilir, ancak floresan kalitesi birkaç gün sonra düşmeye başlar.
7. 100X büyütmede bir floresan mikroskobu kullanarak, spermatekanın hemen bitişiğinde olan ve henüz spermateka veya uterusa girmemiş olan en olgun döllenmemiş oositteki tek DAPI cisimlerinin (muhtemelen tek kromozom çiftleri) sayısını puanlayın.
   1. Bir oosit çekirdeği içindeki bireysel DAPI cisimlerini puanlamak için, sayım sırasında oosit çekirdeğinin üstünden aşağıya doğru yavaşça hareket etmek için mikroskobun ince odağını kullanın. Ardından, sayılan DAPI cisimlerinin sayısını doğrulamak için odağı ters yönde (yani çekirdeğin altından üstüne doğru) hareket ettirirken aynı çekirdeği yeniden sayın.
8. Kararlı Lon suşu başına en az on hermafroditte iki gonadın her birinde en olgun döllenmemiş oositi puanlayın. Yabani tip oositler ortalama olarak 6 DAPI cisimciğine, 5 otozom çiftine ve cinsiyet kromozom çiftine sahiptir. Kararlı Lon suşlarının oositinde 12 DAPI cisiminin varlığı, bu suştaki hayvanların ya kısmi (4 set Otozom, 3 X-kromozomu) ya da tam (4 set Otozom, 4 X-kromozomu) tetraploid olduğunu gösterir.
9. Suş başına birden fazla (en az 10) oositten gözlemlenen ortalama DAPI cisimciği sayısını hesaplayın. Bazı kromozom çiftleri birbirine değecek veya üst üste gelecektir, bu nedenle bir oositteki DAPI cisimciklerinin sayısı genellikle gerçek kromozom çiftlerinin sayısından daha küçüktür.
10. (İsteğe bağlı) HTP-3 gibi kromozom ekseni proteinlerine karşı immünofloresan boyama ile tam (4A, 4X) veya kısmi (4A, 3X) tetraploid olup olmadıklarını test etmek için ortalama DAPI cisimciği sayısının 12 olduğu kararlı Lon suşlarını daha da doğrulayın. Bu boyama, kısmi tetraploidde bulunan tek bağlantısız kromozomlardan haç biçimli bir model göstererek kromozom çiftlerini ayırt edecektir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Diseksiyon Mikroskobu	Motic Mikroskopi	SMZ171
Name	şirket	Katalog Numarası	Yorum
Boyama
Hoechst 33258, Pentahidrat	Biyotyum	40045
DAPI	Biyotyum	40011
Name	şirket	Katalog Numarası	Yorum
Etanol Fiksasyonu
Etanol, Saf, 190 Kanıt (%95), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	şirket	Katalog Numarası	Yorum
M9 Tamponu
Sodyum klorür, Biyoteknoloji Sınıfı	VWR (VWR)	97061-278
Potasyum fosfat, Monobazik Susuz Sınıf	VWR (VWR)	97062-346
Sodyum fosfat, monobazik dihidrat	Balıkçı Bilimsel	AC271750025