C. elegans Beslemesi için RNAi Kaplama: E. coli'de Hedef dsRNA Ekspresyonunu İndüklemek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Kolundzic, E., et al. C. elegans'ta Germ Hücrelerini Nöronlara Yeniden Programlamak için RNAi ve Isı Şoku Kaynaklı Transkripsiyon Faktörü İfadesinin Uygulanması. J. Vis. Uzm.(2018).

Bu video, C. elegans'ta RNAi tedavisinin arkasındaki prensipleri açıklar ve bir transgenik solucan suşunda lin-35'i nakavt etmek için bir protokol gösterir.

Protokol

Bu protokol, Kolundzic ve ark. C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Çözelti Hazırlama
   1. NGM-Agar plakaları (1 L)
      1. 3 g NaCl, 2.5 g pepton ortamı (örneğin, Bacto-Peptone) ve 20 g agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra 1 mL kolesterol (% 95 EtOH stoğunda 5 mg / mL), 1 mL 1 M MgS4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4 ve 1 mL amfoterisin B (2.5 mg / mL stok).
   2. NGM-Agar RNAi plakaları (1 L)
      1. 3 g NaCl, 2.5 g pepton ortamı ve 20 g agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra 1 mL kolesterol (% 95 EtOH stoğunda 5 mg / mL), 1 mL 1 M MgS4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K₂PO₄, 1 mL amfoterisin B (2.5 mg / mL stok), 1 mL 1 M IPTG ve 1 mL karbenisilin (50 mg / mL).
   3. LB-Agar (1 L)
      1. 10 g pepton ortamı, 5 g maya özütü, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 mL 1 M Tris pH 8.0 ekleyin. H₂O'yu 1 L'ye ekleyin. Otoklavlamadan sonra 1 mL 50 mg/mL karbenisilin ve 2.5 mL 5 mg/mL tetrasiklin ekleyin.
   4. LB Orta (1 L)
      1. 10 g pepton ortamı, 5 g maya özütü, 5 g NaCl ve 10 mL 1 M Tris pH 8.0 ekleyin. H₂O'yu 1 L'ye ekleyin. Otoklavlamadan sonra 1 mL 50 mg / mL karbenisilin ekleyin.
   5. M9 tampon (1 L)
      1. 6.0 g_Na2HPO4, 3 g KH₂PO₄, 5 g NaCl ve 50 mg jelatin ekleyin. Kullanmadan önce 1 mL 1 M_MgS04 ekleyin.
   6. Ağartma solüsyonu (10 mL)
      1. 1 mL NaClO ve 2 mL 5 N NaOH ekleyin. H2O'yu 10 mL'ye ekleyin.
2. RNAi Plakalarının Hazırlanması
   NOT: C. elegans tipik olarak laboratuvarda 7,5 mL Nematod Büyüme Ortamı Agar (NGM-Agar) içeren 6 cm'lik Petri plakaları üzerinde kültürlenir. Bu protokol, 15 °C'de tutulan solucanlar için optimize edilmiştir. NGM'li plaklar hazırlamak için, mantar ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için standart steril teknikler kullanın. Aşağıdakiler, RNAi için reaktiflerle desteklenmiş NGM plakalarını hazırlama protokolüdür.
   1. 1 mM İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ve 50 μg/mL karbenisilin içeren 6 cm'lik NGM-Agar RNAi plakaları hazırlayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 24 – 48 saat kurumaya bırakın¹².
      1. RNAi plakalarını karanlıkta 4 °C'de tutun. 14 günden daha eski ise kullanmayın.
   2. 50 μg/mL karbenisilin ve 12.5 μg/mL tetrasiklin içeren LB-agar plakaları üzerindeki mevcut RNAi kütüphanesinden donmuş gliserol stoğundan lin-53 gen DNA dizisi ile L4440 plazmidini içeren RNAi bakteri (Escherichia coli HT115) klonunu üç fazlı çizgi deseni kullanarak seçin. Bakterileri gece boyunca 37 °C'de büyütün. Bu klon, bakterilerde IPTG'ye bağlı lin-53 dsRNA üretimine izin verir.
      1. Ek olarak, boş vektör kontrolü olarak herhangi bir gen dizisi olmadan L4440 plazmidini içeren RNAi bakterilerini büyütün.
   3. Ertesi gün, 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak lin-53 veya boş vektör LB-agar plakalarından tek bir koloni seçin ve her birini 50 μg/mL karbenisilin ile desteklenmiş 2 mL sıvı LB ortamı içeren ayrı bir kültür tüpüne aşılayın. Kültürleri, 600 nm'de 0,6 – 0,8 optik yoğunluğa (OD) ulaşana kadar 37 ° C'de gece boyunca büyütün. OD'yi bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
      DİKKAT: Sıvı LB ortamı, bakterileri gliserol stoğundan ayırmak için kullanılan LB-agar plakasının aksine tetrasiklin içermemelidir, çünkü besleme sırasında tetrasiklin dahil edilmesi RNAi verimliliğinin azalmasına neden olur.
   4. Her bakteri kültüründen (lin-53 veya boş vektör) 500 μL'yi bir multipipet kullanarak 6 cm NGM-Agar RNAi plakalarına ekleyin. Plakaları kapalı bir kapakla gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuruması için inkübe edin. Bu süre zarfında, NGM plakalarındaki IPTG, bakterilerde dsRNA üretimini indükleyecektir.
      1. Deney başına bakteri kültürü başına en az 3 plaka kullanın. Bu, her deney için 3 teknik kopya sağlayacaktır.
   • Kurutulmuş NGM-agar RNAi plakalarını bakteri ile birlikte 4 °C'de karanlıkta iki haftaya kadar saklayın.
3. C. elegans Suşu BAT28'in Hazırlanması
4. OTIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] ve ntIs1 [gcy-5prom::gfp] transgenlerini içeren BAT28 solucan suşunu OP50 bakterileri üzerinde 15 ° C'de standart NGM-Agar plakaları kullanarak koruyun.
   NOT: Nematod kültürü ile ilgili ayrıntılı protokol için bkz. Rol-6 (su1006), tipik yuvarlanma hareketine neden olan baskın bir alel ve yaygın olarak kullanılan fenotipik enjeksiyon markörü^16'dır. otIs305 transgeninde hsp-16.2prom::che-1'i izlemek için kullanılır.
   1. hsp-16.2prom::che-1 transgeninin erken aktivasyonunu önlemek için BAT28 suşunu her zaman 15 °C'de tutun. Suşu mümkün olduğunca ele alırken 15 °C'den daha yüksek sıcaklıklara maruz kalmayı azaltın.
5. Solucanları yaşla senkronize etmek için ağartma tekniğini kullanın.
   1. BAT28'in yetişkinlerini ve yumurtalarını içeren 6 cm'lik NGM-Agar plakalarını 900 μL M9 tampon kullanarak yıkayın. 1 dakika boyunca 900 x g'da santrifüj ederek pelet kurtları. Süpernatanı çıkarın.
   2. 0,5 – 1 mL ağartma solüsyonu ekleyin ve yetişkin solucanlar açılmaya başlayana kadar tüpü yaklaşık 1 dakika çalkalayın. Standart bir stereomikroskop kullanarak izleyin.
   3. Pelet kurtları 1 dakika boyunca 900 x g'da santrifüj ederek. Süpernatanı çıkarın.
   4. Solucan peletini 800 μL M9 tamponu ekleyerek ve 900 x g'da santrifüjleyerek 3 kez yıkayın.
   5. Temizlenmiş yumurtaları OP50 bakterisi ile tohumlanmış taze NGM plakalarına yerleştirin. OP50 bakterileri üzerinde 15 ° C'de L4 aşamasına ulaşana kadar (yaklaşık 4 gün) ağartılmış bir popülasyon oluşturun. L4 larvaları, standart bir stereomikroskop kullanılarak solucanın ventral tarafının yaklaşık yarısında beyaz bir yama ile tanınabilir.
      NOT: Lin-53'ün tükenmesi üzerine germ hücresinden nörona dönüşüm fenotipini elde etmek için, ebeveyn neslinde (P0) tükenmesi gerekir. Dönüşüm fenotipi için puanlama bir sonraki nesilde (filial nesil F1) yapılır. Zaten P0'da bulunan tükenmiş lin-53'ü elde etmek için, L4 hayvanları RNAi'ye tabi tutulur.
6. Bir platin tel kullanarak replike başına 50 L4 aşama solucanını herhangi bir bakteri içermeyen bir NGM plakasına manuel olarak aktarın ve solucanların aktarılan herhangi bir OP50 bakterisinden uzaklaşmasına izin verin. Solucanların plaka üzerinde yaklaşık 5 dakika hareket etmesine izin verin. İlgili RNAi plakalarına aktarmak için daha önce lin-53 RNAi bakterileri (veya boş vektör kontrolü) ile tohumlanmış NGM-Agar RNAi plakalarından bakterileri kullanın.
   1. OP50 bakterilerini gerçek RNAi plakalarına aktarmaktan kaçının. Gerginliğin 15 °C'den daha yüksek sıcaklıklara maruz kalma süresini en aza indirmek için hızlı çalışın.
7. Solucanları NGM-Agar RNAi plakaları üzerinde 15 °C'de yaklaşık 7 gün boyunca solucanların F1 dölleri L3 – L4 aşamasına ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. F1 döllerinden daha büyük ve daha kalın oldukları için P0 hayvanlarından net bir şekilde ayrılabilirler.
   1. F1 döl solucanlarının Şekil 1'de gösterildiği gibi çıkıntılı vulva (pvul) fenotipini gösterip göstermediğini standart bir stereomikroskop altında görsel olarak kontrol edin. Lin-53'e karşı RNAi, pleiotropik etkilere sahiptir ve lin-53'e karşı RNAi'nin başarılı olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilecek pvul fenotipine neden olur.
      NOT: lin-53'e karşı RNAi de F1 embriyolarının ölümcüllüğüne neden olabilir. Bu etki, hayvanlar L3 – L4 aşamasına ulaşmadan önce plakalar 15 °C'den daha yüksek derecelere maruz kalırsa artar. Ölü embriyolar, gelişimin durması ve kuluçka eksikliği ile tanınabilir.
   2. IPTG ışığa duyarlı olduğu için plakaları karanlıkta inkübe edin.

Sonuçlar

Şekil 1: RNAi'nin lin-53'e karşı oluşturduğu Pvul fenotipi. (Üstte) Kontrol veya lin-53 RNAi ile tedavi edilen annelerden türetilen L4/genç yetişkin evre F1 döl solucanlarının DIC resmi. Ölçek çubukları = 20 μm. (Altta) lin-53 RNAi ile tedavi edilen hayvanlar, çıkıntılı vulva (pvul) fenotipini (siyah ok uçları) gösterir. Pvul fenotipi, lin-53'e karşı RNAi'nin b...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kimyasallar
Agar-Agar, Kobe I	Roth	5210.1
Bactopeptone	A. Hartenstein GmbH	211 677	Pepton Medya
Maya özü	Uygulama Kimyası	A1552,0100
Amfoterisin B	USBiyolojik	A2220
CaCl2	Merck Biyolojik Bilimler	208290
Kolesterol	Roth	8866.2
Jelatin	Roth	4275.3
IPTG	Sigma	15502-10G
K2PO4	Roth	T875.2
KH2PO4	Roth	3904.2
MgSO4	VWR (VWR)	25.163.364
Na2HPO4	Roth	P030.1 Serisi
NaCl	Roth	9265.1
NaClO	Roth	9062.3
NaOH (5 N)	Roth	KK71.1
Tris	Roth	AE15.2
Karbenisilin	Roth	634412
Tetrasiklin	Roth	2371.2
Kuluçka Makineleri
Kuluçka makinesi	Sanyo MIR-5	5534210	15 °C veya 25 °C'de solucan suşlarının bakımı için
Mikroskoplar
Stereomikroskop	SMZ745	Nikon
Bakteri suşları
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lizojen: lavUV5promoter -T7 polimeraz) (IPTG ile indüklenebilir T7 polimeraz) (RNAseIII eksi).
		Urasil oksotrof, E. coli suşu
Solucan türleri
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			OH9846'dan N2 ile 4 kat daha fazla geri çaprazlama ile türetilmiştir
RNAi Klonları
lin-53	KaynakBiyobilim	Kimlik I-4D14	Ahringer kütüphanesi 16B07 ChromI, K07A1.12
boş vetor: L4440	Ekle	#1654

sayılı Kanun Hükmünde Kararname (İngilizce) Serisi Serisi (İngilizce) (İngilizce) (İngilizce) Serisi Serisi Serisi < td >Escherichia coli OP50