Sıvı Kültürde RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Bu protokol, Groh ve ark. Caenorhabditis elegans'ta Yaşla Birlikte Doğal Protein Agregasyonundaki Değişiklikleri İnceleme Yöntemleri, J. Vis. Exp. (2017).

1. İlgilenilen bir geni hedefleyen RNAi'ye maruz kalan genç ve yaşlı hayvanları toplamak için gonadsız hayvanların sıvı kültürü

NOT: Bazı genlerin RNAi'ye tepkisi, daha önce açıklandığı gibi sıcaklığa bağlı olabilir. RNAi'ye bir alternatif olarak, bir mutant gen gon-2 (-) arka planına dahil edilebilir.

1. Sıvı kültür için bakteri hazırlanması
   1. OP50 ve RNAi bakterilerini (istenen dsRNA'yı üreten bakteriler ve kontrol olarak boş vektörlü bakteriler) 4 L LB ortamını 12 mL ilgili bakteri kültürü ile aşılayarak hazırlayın (RNAi bakteri kültürlerine 50 μg/mL karbenisilin ve 1 mM IPTG nihai konsantrasyon ekleyin) ve bunları gece boyunca 37 °C'de 180 rpm'de inkübe edin.
   2. Ertesi gün kültürleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6.700 x g'da hasat edin. Süpernatanları çıkarın ve her peleti 60 mL buz gibi soğuk S bazal ortamda (100 mM NaCl, 50 mM Potasyum fosfat pH 6, buz üzerinde tutulur) yeniden süspanse edin. Üç yeniden süspanse edilmiş peleti (OP50, kontrol RNAi bakterileri ve ilgilenilen gen için RNAi bakterileri) adım 1.2.
      'ye kadar 4 ° C'de tutun NOT: Solucanlar, L1 aşamasından itibaren RNAi üzerinde veya son larva aşaması L4'ten itibaren gelişimsel kusurları önlemek için büyütülebilir (bkz. adım 1.2).
2. Son larva evresi L4'ten başlayarak RNAi ile tedavi için sıvı kültür
   1. Bir Fernbach kültür şişesine (kapasite 2.800 mL) 200 mL S bazal ortam ekleyin. 300 mL'lik bir nihai kültür hacmi için (bkz. 1.2.2.4), 10 mM potasyum sitrat, pH 6, 3 mL eser metal çözeltisi (5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 2.5 mM_FeS4, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0.1 mM CuSO₄), 3 mM_MgSO 4, 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL karbendazim ve 5 μg/mL kolesterol). Şişeyi bir membran vidalı kapakla kapatın. Tampon tarifleri için Tablo 1'e bakın.
   2. L1'leri 25 °C'den çıkarın ve 15 mL'lik tüplere aktarın. 3 dakika boyunca 1.900 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 2 μL'deki L1'leri sayın. Önceki adımda hazırlanan Fernbach kültür şişesine 500.000 L1 ekleyin.
   3. OP50'yi (adım 1.1'den itibaren) solucan sayısıyla orantılı olarak ekleyin. Örneğin, 500.000 solucan için 60 mL OP50 ekleyin.
   4. Toplam hacmi 300 mL'ye getirmek için S bazal ile tam solucan kültürü. Solucan kültürünü, 150 rpm'lik çalkalama makinesinde, 25 ° C'de L4 aşamasına kadar inkübe edin.
   5. Ertesi gün, solucanlar vahşi tip L4'lerin boyutunda olmalıdır. OP50'den RNAi bakterisine geçmek için, hayvanları altı adet 50 mL'lik tüpte toplayın, çökelmelerine izin verin ve süpernatanı çıkarın. Kalan OP50 bakterilerini gidermek için L4'leri M9 ile yıkayın: 1900 x g'da 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve tüm L4'leri 50 mL'lik bir tüpe aktarın. 4 μL'de L5'leri sayın (en az dokuz kez). Genç solucan toplama için iki kez 50.000 L4'e ve yaşlı solucan toplama için iki kez 100.000 L4'e ihtiyaç vardır.
   6. 1.2.2.1'de açıklandığı gibi dört Fernbach kültür şişesi hazırlayın. Ayrıca her şişeye 50 μg / mL Karbenisilin ve 1 mM IPTG'lik bir nihai konsantrasyon ekleyin.
   7. İlgilenilen gen için kontrol RNAi bakterileri ve RNAi bakterileri (adım 1.1'den itibaren) solucan sayısıyla orantılı olarak ekleyin: Genç solucanlar için şişe başına 7 mL ve yaşlı solucanlar için şişe başına 14 mL ekleyin.
   8. Genç solucan toplama için şişe başına 50.000 solucan ve yaşlı solucan toplama için şişe başına 100.000 solucan ekleyin ve kültürleri 300 mL'ye kadar doldurmak için S bazal ile tamamlayın. Solucan kültürlerini (toplam dört) 25 °C ve 150 rpm'de inkübe edin.

2. C. elegans sıvı kültürlerinin bakımı

1. Her sıvı kültürden periyodik olarak bir alikot toplayın ve kontaminasyon olmadığını doğrulamak için bir cam lam üzerine (alternatif olarak bir agar plakası üzerine) yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, özellikle büyüme aşamasında kültürdeki bakteriyel gıda seviyelerini kontrol edin. Adım 1.1'de tarif edildiği gibi ilgilenilen gen için 2 L kontrol RNAi bakterisi ve RNAi bakteri kültürünü önceden hazırlayın. Gerekirse bunları C. elegans sıvı kültürlerine ekleyin ve geri kalanını 4 °C'de tutun.
2. Hayvanların kısır olup olmadığını periyodik olarak kontrol edin. Hayvanların çoğunda gonad olmaz. Gon-2 mutasyonunun penetransına bağlı olarak, bazıları iptal edilmiş gonadal yapılara sahip olabilir, ancak yumurtası olan hiçbir hayvan gözlenmemelidir.

Tablo 1.