Sıvı Kültürde RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Groh, N. et al. Caenorhabditis elegans'ta Yaşla Birlikte Doğal Protein Agregasyonundaki Değişiklikleri İnceleme Yöntemleri. J. Vis. Uzm.(2017).

RNAi, C. elegans araştırmacılarının kullanabileceği güçlü bir genetik araçtır. Bu video, sıvı kültür koşullarını kullanarak plaka beslemeden daha fazla solucanı RNAi ile tedavi etmek için bir yöntem sunmaktadır.

Protokol

Bu protokol, Groh ve ark. Caenorhabditis elegans'ta Yaşla Birlikte Doğal Protein Agregasyonundaki Değişiklikleri İnceleme Yöntemleri, J. Vis. Exp. (2017).

1. İlgilenilen bir geni hedefleyen RNAi'ye maruz kalan genç ve yaşlı hayvanları toplamak için gonadsız hayvanların sıvı kültürü

NOT: Bazı genlerin RNAi'ye tepkisi, daha önce açıklandığı gibi sıcaklığa bağlı olabilir. RNAi'ye bir alternatif olarak, bir mutant gen gon-2 (-) arka planına dahil edilebilir.

1. Sıvı kültür için bakteri hazırlanması
   1. OP50 ve RNAi bakterilerini (istenen dsRNA'yı üreten bakteriler ve kontrol olarak boş vektörlü bakteriler) 4 L LB ortamını 12 mL ilgili bakteri kültürü ile aşılayarak hazırlayın (RNAi bakteri kültürlerine 50 μg/mL karbenisilin ve 1 mM IPTG nihai konsantrasyon ekleyin) ve bunları gece boyunca 37 °C'de 180 rpm'de inkübe edin.
   2. Ertesi gün kültürleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6.700 x g'da hasat edin. Süpernatanları çıkarın ve her peleti 60 mL buz gibi soğuk S bazal ortamda (100 mM NaCl, 50 mM Potasyum fosfat pH 6, buz üzerinde tutulur) yeniden süspanse edin. Üç yeniden süspanse edilmiş peleti (OP50, kontrol RNAi bakterileri ve ilgilenilen gen için RNAi bakterileri) adım 1.2.
      'ye kadar 4 ° C'de tutun NOT: Solucanlar, L1 aşamasından itibaren RNAi üzerinde veya son larva aşaması L4'ten itibaren gelişimsel kusurları önlemek için büyütülebilir (bkz. adım 1.2).
2. Son larva evresi L4'ten başlayarak RNAi ile tedavi için sıvı kültür
   1. Bir Fernbach kültür şişesine (kapasite 2.800 mL) 200 mL S bazal ortam ekleyin. 300 mL'lik bir nihai kültür hacmi için (bkz. 1.2.2.4), 10 mM potasyum sitrat, pH 6, 3 mL eser metal çözeltisi (5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 2.5 mM_FeS4, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0.1 mM CuSO₄), 3 mM_MgSO 4, 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL karbendazim ve 5 μg/mL kolesterol). Şişeyi bir membran vidalı kapakla kapatın. Tampon tarifleri için Tablo 1'e bakın.
   2. L1'leri 25 °C'den çıkarın ve 15 mL'lik tüplere aktarın. 3 dakika boyunca 1.900 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 2 μL'deki L1'leri sayın. Önceki adımda hazırlanan Fernbach kültür şişesine 500.000 L1 ekleyin.
   3. OP50'yi (adım 1.1'den itibaren) solucan sayısıyla orantılı olarak ekleyin. Örneğin, 500.000 solucan için 60 mL OP50 ekleyin.
   4. Toplam hacmi 300 mL'ye getirmek için S bazal ile tam solucan kültürü. Solucan kültürünü, 150 rpm'lik çalkalama makinesinde, 25 ° C'de L4 aşamasına kadar inkübe edin.
   5. Ertesi gün, solucanlar vahşi tip L4'lerin boyutunda olmalıdır. OP50'den RNAi bakterisine geçmek için, hayvanları altı adet 50 mL'lik tüpte toplayın, çökelmelerine izin verin ve süpernatanı çıkarın. Kalan OP50 bakterilerini gidermek için L4'leri M9 ile yıkayın: 1900 x g'da 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve tüm L4'leri 50 mL'lik bir tüpe aktarın. 4 μL'de L5'leri sayın (en az dokuz kez). Genç solucan toplama için iki kez 50.000 L4'e ve yaşlı solucan toplama için iki kez 100.000 L4'e ihtiyaç vardır.
   6. 1.2.2.1'de açıklandığı gibi dört Fernbach kültür şişesi hazırlayın. Ayrıca her şişeye 50 μg / mL Karbenisilin ve 1 mM IPTG'lik bir nihai konsantrasyon ekleyin.
   7. İlgilenilen gen için kontrol RNAi bakterileri ve RNAi bakterileri (adım 1.1'den itibaren) solucan sayısıyla orantılı olarak ekleyin: Genç solucanlar için şişe başına 7 mL ve yaşlı solucanlar için şişe başına 14 mL ekleyin.
   8. Genç solucan toplama için şişe başına 50.000 solucan ve yaşlı solucan toplama için şişe başına 100.000 solucan ekleyin ve kültürleri 300 mL'ye kadar doldurmak için S bazal ile tamamlayın. Solucan kültürlerini (toplam dört) 25 °C ve 150 rpm'de inkübe edin.

2. C. elegans sıvı kültürlerinin bakımı

1. Her sıvı kültürden periyodik olarak bir alikot toplayın ve kontaminasyon olmadığını doğrulamak için bir cam lam üzerine (alternatif olarak bir agar plakası üzerine) yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, özellikle büyüme aşamasında kültürdeki bakteriyel gıda seviyelerini kontrol edin. Adım 1.1'de tarif edildiği gibi ilgilenilen gen için 2 L kontrol RNAi bakterisi ve RNAi bakteri kültürünü önceden hazırlayın. Gerekirse bunları C. elegans sıvı kültürlerine ekleyin ve geri kalanını 4 °C'de tutun.
2. Hayvanların kısır olup olmadığını periyodik olarak kontrol edin. Hayvanların çoğunda gonad olmaz. Gon-2 mutasyonunun penetransına bağlı olarak, bazıları iptal edilmiş gonadal yapılara sahip olabilir, ancak yumurtası olan hiçbir hayvan gözlenmemelidir.

Stok çözümü	miktar	Son konsantrasyon	Yorumlar/Açıklama
S bazal (500 mL için: 5.9 g NaCl, 50 mL 1 M Potasyum fosfat pH 6)	200 mL		1 M Potasyum fosfat pH 6: 1 L için: 129 g KH2PO4 monobazik, 52 g K2HPO4 dibazik susuz
1 M Potasyum sitrat pH 6 (400 mL için: 13.1 g sitrik asit monohidrat, 134.4 g tri-potasyum sitrat monohidrat)	3 mL	10 milyon
Eser metal çözeltisi (1 L için: 1,86 g Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 mL		Stok çözeltisini karanlıkta 4 °C'de saklayın
1 M MgSO4 (500 mL için: 123.3 g)	900 μL	3 milyon
1 M CaCl2 (500 mL için: 73,5 g)	900 μL	3 milyon
200 μg/mL Karbendazim (50 mL için: Metanol içinde 10 mg)	150 μL	100 ng/mL
5 mg / mL Kolesterol (100 mL için: Etanolde 0,5 g)	300 μL	5 μg/mL

Tablo 1.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fernbach kültür şişesi	Corning	4425-2XL	Pyrex, Kapasite 2.800 ml, 3 bölme girintili	evet
Membran Vidalı Kapak	Schott	1E+06	GL45	evet
Somunlama Karıştırıcı	VWR (VWR)	444-0148		evet
Ayırıcı huni	Nalgene Belediyesi	4300-1000	Kapasite 1.000 ml	Hayır
1 ml şırınga	BD Plastipak	3E+05		Hayır
Gri iğne, 27 G x 1/2 ", 0,4 mm x 13 mm	BD Mikromızrak 3	3E+05		Hayır
Membran filtreler 0,025 μM	Kırlangıç	VSWP04700		Hayır
pH şeridi	Machery-Nagel	92110	pH Düzeltme 0-14	Hayır
Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Roche	5E+09	Komple Mini EDTA içermeyen tabletler	Hayır
Okoksinol-9	Uygulama	A1388	Triton X-100	Hayır
4-Morfolineetansülfonik asit (MES)	Sigma-Aldrich	M1317		Hayır
Nonilfenilpolietilenglikol	Uygulama	A1694	Nonidet P40 (NP40)	Hayır
DNaseI	Roche	5E+09	rekombinant, RNaz içermez	Hayır
RNaseA (RNaseA)	Promega	A7973	çözüm	Hayır
Toplam protein lekesi boyama	Termo Balıkçı	S11791 Serisi	Sypro Ruby protein leke lekesi	Hayır
Toplam protein jel boyama	Termo Balıkçı	S12001 Serisi	Sypro Ruby protein jel boyası	Hayır
TCEP (tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür)	Serva	36970		Hayır
İyodoasetamid	Serva	26710		Hayır
Amonyumbikarbonat	Sigma-Aldrich	9830		Hayır
Sıralama Sınıfı Modifiye Tripsin	Promega	V5111		Hayır
Bağıl ve mutlak kantitasyon için izobarik etiketler	Sciex (Bilim)	4E+06	iTRAQ Reaktifler Çoklama Kiti	Hayır
Santrifüj Avanti J-26XP	Beckmann Coulter ·	4E+05		evet
Ultrasantrifüj Optima Max-XP	Beckmann Coulter ·	4E+05		Hayır
Santrifüj 5424R	Eppendorf Belediyesi	5E+09		evet
Santrifüj 5702	Eppendorf Belediyesi	6E+09		evet
Santrifüj Megafüj 40R	Termo Bilimsel	8E+07		Hayır
Yoğunlaştırıcı Artı	Eppendorf Belediyesi	5E+09	Santrifüj evaporatör	Hayır
Floresan stereo mikroskop M165 FC	Leica Belediyesi		Planapo 2.0x hedefi ile	Hayır
Diseksiyon mikroskobu	Leica Belediyesi		Leica S6E	evet
Yüksek büyütme mikroskobu Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		PlanAPOCHROMAT 20x objektif ve Zeiss Axio Cam MRm ile	Hayır
yazılım				Hayır
Görüntü analiz yazılımı	ResimJ			Hayır
Kütle spektrometresi verilerinin analizi	Protein Arayıcısı		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	Hayır
E.coli suşları
OP50	CGC (Cesaret Gösteri
RNAi bakterileri
L4440	Julie Ahringer RNAi kütüphanesi
C. elegans mutantları
CF2253	CGC, suş adı: EJ1158		Genotip: gon-2 (q388)
C. elegans transgenikleri
DCD214	Della David'in DZNE Tübingen'deki laboratuvarı		Genotip: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	Della David'in DZNE Tübingen'deki laboratuvarı		Genotip: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]

Serisi Serisi arası Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Fuar Serisi Gazetesi Fuar Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi