Dört Olfaktometre Testi: Drosophila'da Koku İşaretli Tepkileri Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Lin, C.C., et al. Dört kadranlı bir Olfaktometrede Drosophila'nın Bilgisayar İzlemesi ile Test Edilen Koku Alma Davranışları. J. Vis. Uzm. (2016).

Meyve sinekleri karmaşık bir koku alma sistemine sahiptir, yüzlerce koku maddesini ayırt edebilir ve davranışsal kararları yönlendirmek için koku alma duyularını kullanabilirler. Bu video, sineklerde koku alma davranışsal tepkilerini incelemek için bir yöntem olan dört olfaktometre testini açıklamaktadır. Öne çıkan protokol klibi, test sineklerinin nasıl ele alınacağını ve testi gerçekleştirirken kritik adımların neler olduğunu gösterir.

Protokol

Bu protokol, Lin ve ark., Dört Kadranlı Olfaktometrede Drosophila'nın Bilgisayar İzlemesiyle Gözlemlenen Koku Alma Davranışları, J. Vis. Exp. (2016).

1. Çekici ve İtici Koku Maddelerine Davranışsal Tepkiler

1. Sıcaklık kontrol cihazını açın ve 25 °C'ye ayarlayın.
2. Boruyu koku haznesinin çıkışına ve davranış kutusundaki bas-bağla bağlantısına takarak koku verici haznelerini (koku maddelerini kontrol edin ve test edin).
3. Kontrol ve koku verici hava akışlarının 100 ml/dk'ya eşit olduğundan emin olmak için hava akış ölçeri kullanarak her kadrandaki akış hızını kontrol edin.
4. PTFE sinek arenasını ve cam plakaları p etanol ile 2-3 kez temizleyin ve tamamen kurumaya bırakın (~ 3-4 dakika).
5. Cam plakaları arenaya kelepçelerle sabitleyin.
6. CO₂ anestezisi olmadan sinekleri cam plakalardan birindeki delikten arenaya aktarın. Aktarımdan sonra, sineklerin kaçmasını önlemek için deliğe dairesel bir ağ yerleştirin.
   NOT: CO₂ anestezisinin Drosophila davranışını etkilediği gösterilmiştir ve davranışsal bir deneyden sonraki 24 saat içinde kullanılmamalıdır.
7. Sinekli arenayı ışık geçirmez hazneye yerleştirin, davranış kutusundaki bas-bağla bağlantısına bağlı boruyu arena köşelerine bağlayarak dört kontrol hava akımını bağlayın, haznenin kapısını kapatın ve sineklerin yeni ortama alışması için 10-15 dakika bekleyin. Mümkünse, deney sonucunu saptırabilecek olası minimum ışık sızıntısını önlemek için deneylerin yapıldığı odadaki ışıkları kapatın.
8. Sineklerin 4 kontrol hava akımına maruz kaldığı 5-10 dakikalık bir kontrol deneyi yapın.
9. Sineklerin arenada eşit şekilde dağıldığından ve Cazibe İndeksi'nin 0'a yakın olduğundan emin olmak için verileri hemen analiz edin (aşağıdaki Veri analizi bölümüne bakın). Bu adım, arenada kontrolsüz tercih veya kaçınma kaynaklarının olmadığını doğruladığı için önemlidir (örn. dışarıdan sızan ışık, eşit olmayan sıcaklık dağılımı, eşit olmayan arena, koku kirliliği vb.). Sinekler eşit olmayan bir şekilde dağılmışsa veya lokomotor aktiviteleri düşükse, sinekleri atın, arenayı tekrar temizleyin (Adım 1.4) ve deneyi tekrarlamak için yeni bir sinek partisi kullanın.
10. 3 vanaları açarak veya konektör borularını yeniden takarak test koku verici odasını kuruluma bağlayın.
11. Test deneyini 5-10 dakika boyunca çalıştırın ve verileri aşağıdaki bölüm 2'de açıklandığı gibi analiz edin (Şekil 1). 20 dakikadan uzun kayıtlar, hesaplamalı olarak işlenmesi zor olabilecek veri dosyalarına neden olabilir. Daha uzun deneysel kayıtlar isteniyorsa, izleme programını hızlı bir şekilde durdurun ve yeniden başlatın. Bu, deneysel kayıtlar arasında ~10 saniyelik bir boşluğa neden olur.
12. Sinekleri atın.
13. Arena ve cam plakaları p etanol ile temizleyin (Adım 1.4) ve ışık geçirmez muhafaza içindeki bağlantı borularını değiştirin. Deneyleri hızlandırmak için yeni bir temiz arena kullanılabilir ve deneysel çalıştırmalar yapılırken kirli arena temizlenebilir.
14. Gerekirse, yeni bir sinek grubuyla başka bir deney yapın. Aynı gün içinde birkaç deney yapılırsa, sistemde önceki bir test çalıştırmasından koku kalmadığından emin olmak için çok dikkatli olun. Bu normalde düşük konsantrasyonlarda koku maddeleri veya CO₂ ile ilgili bir sorun değildir, ancak yüksek konsantrasyonlu uyaranlar için deneysel çalışmalar arasında 24 saatlik bir boşluğa kadar gerekli olabilir. Ek olarak, kontrol deneyleri sırasında koku verici kontaminasyondan şüphelenilirse, akış tüplerinden sonraki tüm borular değiştirilebilir. Sistemi sürekli olarak yıkamak için deneyler arasında daima kuru havayı açık bırakın.

2. Veri Analizi

NOT: Önerilen sinek izleme edinme yazılımı (Malzemeler'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır), edinme sırasında sinekleri gerçek zamanlı olarak izler ve algılanan tüm sineklerin zaman damgasını ve koordinatlarını *.dat biçiminde kaydeder. Verileri Matlab formatına dönüştürmek ve verileri analiz etmek için özel yapım bir Matlab rutini geliştirdik. Kod örnekleri Ek Materyaller'de verilmiştir, ancak uygulama ayrıntıları, veri toplama için kullanılan yazılıma bağlı olacaktır.

1. Ham verileri yükleyin. Arenanın dış hatlarını takip eden bir uzamsal maske oluşturun ve gürültüyü temsil ettikleri için arenanın dışında kalan tüm veri noktalarını kaldırmak için maskeyi ham verilere uygulayın (Şekil 2A, Ek Kod MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. 3 saniyeden daha uzun süre 0,163 cm/sn'nin altındaki bir hızda hareket eden tüm veri noktalarını kaldırın, çünkü bu verilerin gürültü olması veya hareket etmeyen sinekler tarafından oluşturulması muhtemeldir (Şekil 2B, Ek Kod TemporalFiltering.m).
3. Kalan veri noktalarını, hepsini bir kerede veya tek yörüngeler olarak çizerek görselleştirin (Şekil 1, Ek Kod SingleTrajectoryViewer.m).
   NOT: Dört alandaki koku sınırlarının konumu, muhtemelen her bir koku maddesinin özellikleri ve kullanılan hava akış hızları gibi bir dizi faktöre bağlıdır. Örneğin, yüksek derecede uçucu koku maddeleri, koku kadranını daha az uçucu koku maddelerinden daha tam olarak dolduracaktır. Bu nedenle, her bir koku maddesinin biraz farklı koku sınırları sergilemesi muhtemeldir. Koku sınırlarını ölçmek için bir fotoiyonizasyon dedektörünün kullanılması, belirli bir noktadan hava örneklemek için bir vakum kullandığından ve bu nedenle o noktadaki koku konsantrasyonunun bozulmasından sorunlu olabilir. Bununla birlikte, koku sınırları, sinek davranışsal verilerine dayalı olarak hızlı bir şekilde tahmin edilebilir. Örneğin, farklı kokulara yanıt olarak kümülatif sinek izlerine dayanan bir koku sınırı, Şekil 1 C ve 1D'de açıkça gözlemlenebilir.
4. Kontrol deneylerinin tercih yanıtı üretip üretmediğini belirlemek ve ayrıca bir koku verici (veya optogenetik) uyarana verilen yanıta erişmek için bir çekim indeksi hesaplayın. Bir Çekim İndeksi (AI) hesaplamak için bir kontrol veya test kaydının son 5 dakikasını kullanın. +1 (mutlak çekim) ile -1 (mutlak itme) arasında kalan bir çekim ölçüsü elde etmek için, AI'yı hesaplamak için aşağıdaki formül kullanılır:
   
   N_testi, test çeyreğindeki veri noktalarının sayısıdır, N_kontrolü, üç kontrol çeyreğindeki veri noktalarının ortalama sayısıdır. Hiçbir tercih sıfıra yakın değerlerle gösterilmeyeceği için bu ölçü sezgiseldir. Bununla birlikte, koku çeyreğinde bulunan toplam sinek sayısının oranını doğru bir şekilde göstermez. Bu ölçüyü elde etmek için bir Yüzde İndeksi (PI) kullanılabilir:
   
   burada N_testi, test çeyreğindeki veri noktalarının sayısıdır ve N_toplamı, dört çeyreğin tümündeki toplam veri noktası sayısıdır. Bu formül, 0 ile 1 arasında kalan bir ölçü sağlar ve 0,25 hiçbir davranışsal tercihe karşılık gelmez (Şekil 1E ve 2C, Ek Kod AttractionIndex.m).
5. Her tekrar için yeni bir sinek grubu kullanarak her deneysel koşulun 5-10 tekrarını çalıştırın. Kolmogorov-Smirnov non-parametrik testini (Şekil 1F, Matlab'da kstest2 fonksiyonu) kullanarak koşullar arasındaki veya kontroller arasındaki çekim indekslerini karşılaştırın.

Sonuçlar

Şekil 1: Dört Alanlı Koku Tahlili Kullanılarak Oluşturulan Örnek Veriler. (A) Dört alanlı arenanın şeması. (B) Dört kadranın tümü sadece kuru hava perfüzyonu içerdiğinde nötr tepkiler gözlenir. (C) Sol üst kadrandan perfüze edilen elma sirkesinin% 6.25'lik bir seyreltilmesine çekim tepkileri. (D) etil propiyonat tarafından tetiklenen itme davranışları. Ş...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hava dağıtım sistemi			(Gerekli miktar)
Boru ve konektörler
Termoplastik NPT(F) Manifoldları	Cole-Parmer, IL, Amerika Birleşik Devletleri	R-31522-31	1
Altıgen küçültücü meme ucu (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	5232T314	1
Borular (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	5108K43	50 Ft
Borular (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	52355K41	100 Ft
Dikenli boru bağlantı parçaları	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	5117K71	1 paket
Bas-bağla boru bağlantı parçaları	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	5779K102	4
Dikenli Boru Ek Parçaları (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	5463K439	1 paket (10)
Dikenli Boru Ek Parçaları (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	5463K438	2 adet (10)
Dikenli Boru Ek Parçaları (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	5463K4	2 adet (10)
Dikenli Boru Ek Parçaları (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	5670K84	1
Altıgen başlı fiş	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	48335K152	1
Hava basınç regülatörü, hava filtresi ve debimetreler			(Gerekli miktar)
Labatory gaz kurutma ünitesi	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, ABD	Model: L68-NP-303; stok #26840	1
150 mm akış tüpleri için çok tüplü çerçeveler	Cole-Parmer, IL, Amerika Birleşik Devletleri	R03215-30	1
150 mm akış tüpleri için çok tüplü çerçeveler	Cole-Parmer, IL, Amerika Birleşik Devletleri	R03215-76	1
150 mm akış tüpleri	Cole-Parmer, IL, Amerika Birleşik Devletleri	R-03217-15	9
Valf Kartuşu	Cole-Parmer, IL, Amerika Birleşik Devletleri	R-03218-72	9
Hassas Hava regülatörü	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	6162K13	1
Soleniod valfler	Bilimsel Otomasyonu, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valf kontrolörü	ValveLink 8.2, Bilimsel Otomatikleştirme, Berkeley, CA	18 Ocak	1
Elektronik akış ölçer	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, Ulusal Enstrümanlar) ve bir	Ulusal Enstrümanlar	NI USB-6009	1
güç kaynağı	Extech Instruments	382200	1
Koku odaları
Polipropilen Geniş Ağızlı kavanoz 2 oz; 60 ml	Nalgene Belediyesi	562118-0002	Deney başına en az 5 tane gereklidir, ancak her koku maddesinin her bir dilüsyonu için ayrı bir oda gereklidir. Container Store'da mevcuttur, bölüm #635114)
Cam koku odası, 0.25 oz	Güneş Patlaması Şişesi	LB4B	Deney başına en az 5 tane gereklidir
Koku odası için "Giriş" valfi	Akıllı Ürünler, Inc., CA, ABD	214224PB-0011S000-4074	Bu parçalardan 1 tanesi koku odası başına kullanılır, ancak sık sık değiştirilmeleri gerekir
Koku odası için "Çıkış" valfi	Akıllı Ürünler, Inc., CA, ABD	224214PB-0011S000-4074	Bu parçalardan 1 tanesi koku odası başına kullanılır, ancak sık sık değiştirilmeleri gerekir
O yüzük	RT Dygert Uluslararası, MN, Amerika Birleşik Devletleri	AS568-029 Buna-N O-R	1 paket (100)
Fly arena, kamera ve davranış kutuları			(Gerekli miktar)
Davranış ve kamera kutusu malzemesi	Eyaletler arası plastik, CA, ABD	ABS siyah ekstrüde (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 metrekare
Sinek arenası ve koku odası ekleri için teflon, 3/8" kalınlık, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	8545K27	1
Cam plakalar, 1/8" Kalınlık, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, Amerika Birleşik Devletleri	8476K191	2
Çift etkili termoelektrik kontrolör	WAtronix Inc, CA, Amerika Birleşik Devletleri	DA12V-K-0	1
IR LED dizisi	Gelişmiş Aydınlatma, Rochester, VT, ABD	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED dizisi ve bir güç kaynağı
Klima Ünitesi	Melcor Mağazası	MAA280T-12	1
Görüntüleme sistemi			(Gerekli miktar)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B VE H FOTOĞRAF VE ELEKTRONIK A.Ş., NY, ABD	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Ara Bağlantı Kablosu	B VE H FOTOĞRAF VE ELEKTRONIK A.Ş., NY, ABD	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Kamera Adaptörü	B VE H FOTOĞRAF VE ELEKTRONIK A.Ş., NY, ABD	SODC700	1
S+B 40,5 093 IR filtresi	B VE H FOTOĞRAF VE ELEKTRONIK A.Ş., NY, ABD	65-072442	1
TiFFEN 40,5 mm Dairesel polarizör	Amazon		1
Kızılötesi Video Kamera	Endüstriyel Vizyon Kaynağı, FL, ABD	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video dönüştürücü	Görüntüleme Kaynağı, NC, ABD	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (sinek izleme yazılımı)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture yazılımı	Görüntüleme Kaynağı, NC, ABD	(http://www.theimagingsource.com/)
çeşitli			(Gerekli miktar)
Dremel döner alet	Dremel, Racine, WI, Amerika Birleşik Devletleri	Dremel 8000-03	1
Cam kesimi için elmas kaplı matkap uçları	Çeşitli tedarikçilerden temin edilebilir; MSC Endüstriyel Tedarik A.Ş., Melville, NY	90606328	1

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi