Drosophila Y-labirent Testi: Sineklerde Koku Alma Tepkilerini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu makalede

Özet

Kaynak: Simonnet, M. M., et al. Drosophila Koku Alma Testini Y-labirent Testi ile Test Etme. J. Vis. Uzm. (2014).

Bu videoda, meyve sineğinde koku alma keşif davranışını test etmek için Y-labirenti adı verilen bir yöntem açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol klibi, testin nasıl kurulacağını ve yürütüleceğini gösterir.

Protokol

Bu protokol metni, Simonnet ve diğerleri, Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Başlamadan Önce

İstikrarlı ve sağlam davranışsal fenotipler taşıyan izogenleştirilmiş bir referans stoğu kullanın. Bu stoğu seçmek için genel bir kural yoktur, çünkü tüm potansiyel kontroller heterojen arka plan alelleri taşıyabilir.
Daha sonraki adımlar için gerekli olan diğer tüm stokları geri çaprazlamak için bu kontrol gerilimini kullanın. Bu geri çaprazlama adımı tipik olarak, tek bir bakire dişinin (homolog kromozomlar arasında olası çaprazlamaya izin vermek için) 2-3 izojenik referans erkeğe en az 5 ardışık çaprazlaması ile temsil edilir. Bu adım, farklı sinek stokları arasındaki genetik arka planı homojenize etmek için önemlidir.
Drosophila stoklarını standart bir mısır unu (%9), maya (%10) ve antibiyotik (%0,4 metil para-hidroksi-benzoat) ile tamamlanmış agar ortamı (%1,5) üzerinde 25 ° C'de 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüde tutun.
Uzak kırmızı ışık altında (25 ° C) sıcaklık kontrollü bir odada kemosensör deneyleri gerçekleştirin (görsel ipuçlarının katkısını ortadan kaldırmak ve kemosensör sinyallere odaklanmak için). Her deney arasındaki alanı havalandırmak için odanın havasını düzenli olarak yenileyin.

2. Y-labirent Testi kullanarak Koku Alma Tepkisi

Testten önce sinekleri ıslak kağıt havlu içeren cam tüplerde 25 ° C'de 16-18 saat aç bırakın.
Y şeklindeki bir konektörü iki cam şişeye ve daha küçük bir plastik şişeye (yükleme şişesi) birleştirin. Konektörü üç şişeye bağlamak ve sıkıca kapatılmış bir Y labirenti elde etmek için köpük tıpalardan geçen 1 ml pipet uçları kullanın. İki "tuzak" şişesi oluşturmak için iki pipet ucunun dar uçlarını (kararını verdikten sonra sineğin geri dönmesini önlemek için ~2 mm çapında) ve "yükleme" tüpünü oluşturmak için bir pipet ucunun büyük ucunu kesin (Şekil 1A).
"Tuzak" şişelerini (Şekil 1 B) bağlamadan hemen önce, her şişeye bir ~ 6 mm çapında filtre kağıdı yerleştirin. Bir filtre kağıdına 40 μl koku verici solüsyon ve ikinci filtre kağıdına 40 μl karşılık gelen çözücü ekleyin.
On adet 4 ila 9 günlük sinekleri "yükleme" şişesine yerleştirin. Bu transfer sırasında CO₂ anestezisi kullanmayın, çünkü davranış üzerinde güçlü bir etkisi vardır. Bunun yerine buz üzerinde kısa bir soğutma kullanın. Anestezi uygulanmış sineklerin uygun şekilde manipüle edilmesi, denekler üzerindeki stresi mümkün olduğunca sınırlamak için önemlidir.
1. Görsel uyaranlardan mümkün olduğunca kaçınmak için uzak kırmızı ışık altında (olası ısıtma kaynağını sınırlamak için LED ampuller kullanarak) 25 °C'de bir dizi Y-labirent testi gerçekleştirin. Y-labirentlerinin yönlerini değiştirmeye dikkat edin (solda veya sağda koku içeren tüp ve önde veya arkada yükleme tüpü; Şekil 1C).
2. Sineklerin koku verici veya çözücü içeren tuzak şişesine girmesi için birkaç saat bekleyin. Katılımı %80'in üzerine çıkarmak ve maksimum koku indeksi değerini sağlamak için 24 saat sonra sinekleri sayın (Simonnet, kişisel iletişim).
3. Aşağıdaki formülü kullanarak elde edilen koku indeksini hesaplayın: (koku tüpündeki sayı - çözücü tüpündeki sayı) / toplam yüklü sinek sayısı.
Y-labirent kurulumunu aşağıdaki gibi yıkayın: sökülen kurulumu gece boyunca RBS 35 MD'de ıslatın. Musluk suyuyla iyice durulayın. Son olarak deiyonize su ile durulayın ve kurumasını bekleyin.

3. Verilerin İstatistiksel Analizi

Verilere ve değişkenlere bağlı olarak bir t-testi, tek yönlü bir ANOVA veya iki yönlü bir ANOVA gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1: Y labirenti kurulumu ile değerlendirilen erkek koku alma tepkisi. A) Bölünmüş cihaz. B) Monte edilmiş cihaz. C) Uzak kırmızı ışık altında çalışma koşullarında kurulum. D) Her ikisi de damıtılmış suda (% 10 v / v) seyreltilmiş asetik asit (AA) veya fenilasetik aside (PAA) karşı erkek koku alma tepkilerinin nicelleştirilmesi (N = 11, toplam 110 sin...