Bu protokol, Brust-Mascher ve Scholey, Microinjection Techniques for Study Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).
Tarifler:
Üzüm Suyu tabakları:
- 5.5 gr pastırma agar
- 14.5 g dekstroz veya glikoz
- 7.15 gr sükroz
- 45 ml üzüm suyu konsantresi (%100 meyve suyu).
- 204,5 ml H20
- 625 μl 10N NaOH
Tüm malzemeleri ve mikrodalgayı kaynayana kadar karıştırın.
2.8 ml asit karışımı ekleyin (asit karışımı: 20.9 ml propiyonik asit, 2.1 ml fosforik asit, 27 ml H20)
Karıştırın ve 35 mm Petri kaplarının üzerine dökün. Oda sıcaklığında bir veya iki gün katılaşmaya bırakın. Plakalar yakında kullanılmayacaksa, parafilm ile kapatın ve 4 °C'de tutun (kullanmadan önce RT'ye dengelenmesini bekleyin).
Maya macunu:
Kalın bir macun oluşturmak için yaklaşık bir çay kaşığı mayayı (Sigma YSC2, Saccharomyces cerevisiae tip II'den elde edilen maya) suda eritin. Kullanmadan hemen önce her üzüm suyu tabağına bundan küçük bir miktar koyun.
Enjeksiyon tamponu:
- 150 mM K-Aspartat
- 10 mM K-fosfat
- 20 mM imidazol, pH 7.2
Heptan yapıştırıcı:
Çift yapışkan bandı açın ve 100 ml'lik bir şişeye koyun, yaklaşık 50 ml heptan ekleyin, şişeyi kapatın ve birkaç gün sallayın. Kullanırken, yapıştırıcı çok kalınsa heptan ekleyin.
Dehidrasyon odası:
100 mm'lik bir Petri kabı alın, 35 mm'lik bir kabın bir parçasını bir "masa" yapmak için içine koyun ve etrafına Driyerit (susuz kalsiyum sülfat) ekleyin, böylece Driyerit yüksekliği "masadan" daha yüksek olmaz ve örtün. Embriyolu lamel enjeksiyondan önce dehidrasyon için bu "masaya" yerleştirilecektir. En azından bir miktar gösterge Driyerit kullanmak ve renk değiştirdiğinde değiştirmek iyi bir fikirdir.
Protokol:
Bu protokol, hemen hemen her çözünür reaktifin Drosophila sinsityal embriyosuna enjeksiyonu için kullanılabilir: Örneğin, gözlem için bir floresan proteini veya bir hedef protein inhibitörü veya her ikisi.
1. Embriyo toplama
- Döşeme kafesine yeni bir üzüm suyu tabağı koyun.
- Bu plakayı bir saat sonra çıkarın, bu günün ilk koleksiyonudur ve çoğu zaman çok iyi değildir. Atılabilir.
- Her biri bir saat boyunca embriyo toplamaya devam etmek için plakayı her saat değiştirin.
2. Lameli hazırlama
- Mikroskop lamının bir tarafına 50 x 22 mm'lik bir lamel koyun. Slaytın hareket etmemesi için dört köşesini bantlayın.
- Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, lamel üzerine bir satıra bir kat heptan yapıştırıcı koyun (yapıştırıcı viskoz olmamalı ve birkaç saniye içinde kurumalıdır, aksi takdirde daha fazla heptan ekleyin).
- Lamel üzerine lamel tarafına doğru bir parça çift yapışkan bant koyun.
3. Embriyo hazırlama
NOT: Embriyolar, toplama işleminin başlamasından yaklaşık 2 saat sonra görüntülenmelidir, bu nedenle bu zaman dilimi içinde embriyoları bitirmek için yeterli zaman tanıyarak aşağıdaki adımlara başlayın.
- Nemli bir fırça ile embriyoları üzüm suyu tabağından dikkatlice alın ve slayt üzerine çift yapışkan bant üzerine yerleştirin.
- Cımbızın dış kısmını kullanarak, embriyoları koryon (dış zar) açılana kadar çift yapışkan bant üzerinde yuvarlayın.
- Embriyoyu, cımbıza yapışacak şekilde koryonun üzerinde nazikçe yuvarlayarak alın ve embriyonun uzun tarafı lamel uzun kenarına paralel olacak şekilde lamel üzerindeki heptan yapıştırıcının üzerine yerleştirin. Bir sırada 10 ila 20 embriyo ayarlayın.
- Lameli çıkarın ve 3 ila 8 dakika boyunca dehidrasyon odasına yerleştirin (bu, odanın nemine ve enjekte edilecek miktara bağlıdır).
- Vakumlu gres ile metal bir hazneye yerleştirin.
- Daha fazla dehidrasyonu önlemek için embriyoları halokarbon yağı 700 ile kaplayın. Embriyolar artık enjeksiyona hazırdır.
4. Embriyo enjeksiyonu
- 16x hedefin altındaki embriyoları bulun.
- Embriyoları uzaklaştırın ve odak düzlemini hareket ettirmeden iğneyi bulun.
- İğneyi ortalayın ve x veya y yönünde hareket ettirmeden yukarı doğru hareket ettirin.
- İğne açık değilse, lamel kenarını görüş alanına koyun, ancak iğnenin olacağı yere koymayın ve iğneyi aynı odak düzlemine indirin. Lameli iğneye çarpana ve yavaşça kırana kadar çok dikkatli bir şekilde hareket ettirin. İğne açıksa, 5. adıma geçin. (Dolgudan önce hidroflorik asit ile iğneler açılabilir).
- Embriyoları görünecek şekilde yerleştirin (ancak iğnenin olacağı yere değil), iğneyi yağın içine indirin ve iğneden güzel sıvı damlaları aldığınızdan emin olun.
- Embriyoyu dikkatli ama istikrarlı bir şekilde iğnenin içine taşıyın ve embriyoya bir damla enjekte edin ve embriyoyu uzaklaştırın. (Veya enjeksiyon aparatınızın talimatlarını izleyin).
- Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, konfokal mikroskopta gözlem için hazır hale gelirler.
