Işık Noktası Deneyi: Drosophila Fototaktik Davranışını Araştırmak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Sun, Y., et al. Drosophila Larva Fototaksisinin Analizi için Işık Nokta Tabanlı Test. J. Vis. Uzm. (2019).

>Drosophila larvaları ışığa duyarlıdır ve çevredeki ışıktaki değişikliklere tepki verir. Bu videoda, ışık noktası tahlili adı verilen, ışıktan kaçınma yeteneklerini test eden bir tahlil açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, mavi ışıklı bir LED ile testin nasıl kurulacağını ve ışıkla karşılaşmaya yanıt olarak hayvanın davranışının nasıl kaydedileceğini gösterir.

Protokol

Bu protokol metni, Sun ve ark., Drosophila Larva Fototaksisinin Analizi için Işık Noktası Tabanlı Test, J. Vis. Uzm.(2019).

1. Görüntüleme sisteminin kurulumu

1. Yüksek çözünürlüklü bir web kamerasını, masaüstündeki ışık noktasının yaklaşık 10 cm yukarısına, demir klipsli bir kelepçeyle sıkıştırın (Şekil 1).
2. Kamera merceğinin masaüstüne doğru yönünü ayarlayın. Kamerayı bir USB arabirimi aracılığıyla bir bilgisayara bağlayın.
3. Masaüstüne kameranın hemen altına bir agar plakası yerleştirin.
4. Windows 7 yüklü bilgisayarda "Amcap9.22" yazılımını açın ve ışık noktası otomatik olarak AMcap penceresinde gösterilecektir. Işık noktasının pencerenin ortasına yakın olduğundan emin olmak için kamerayı hafifçe sola veya sağa hareket ettirin. Kameranın ışık yolunu engellemediğinden emin olun. Işık noktası tam ve yuvarlak olmalıdır.
   NOT: Yazılım http://amcap.en.softonic.com/ adresinde bulunabilir.
5. 850 nm ± 3 nm bant geçiren filtreyi kameranın hemen altında 5-7 mm'lik bir klipsle sabitleyin.
   NOT: Filtrenin çapı yaklaşık 2,5 cm'dir ve kamera merceğinin çapı 1 cm'den azdır, bu nedenle filtre kameranın görüş alanını kaplayabilir. Kameranın altındaki filtre sayesinde, AMcap penceresinde ışık noktası görülmemelidir.
6. Kızılötesi ışık üreten üç LED'i (merkezi dalga boyu = 850 nm) agar plakasının etrafına eşit şekilde yerleştirin. Her LED, agar plakasının kenarından yaklaşık 5 cm uzakta olmalı ve LED'in lens yüzü, agar plakasına doğru aşağı doğru 70° aşağı açıda olmalıdır. LED'leri AC'den DC'ye dönüştürücü aracılığıyla güce bağlayın.
   NOT: Çeşitli deneysel denemelerde alanın parlaklığının tutarlılığını sağlamak ve daha sonra video işlemeyi kolaylaştırmak için kızılötesi ışık LED'lerinin konumlarını ve açılarını sabitlemek daha iyidir.
7. Bilgisayar ile cihaz arasına bir kara tahta yerleştirin. Bilgisayar ekranı ışığının deneyi etkilemesini önlemek için bilgisayar ekranının parlaklığını azaltın.
   NOT: Işığın dalga boyunu veya yoğunluğunu ölçerken ortamı karanlık tutun.

2. Görüntüleme parametrelerinin ayarlanması

1. AMcap yazılımının menüsünde Seçenekler | Video Cihazı | Formatı yakalayın ve çekilen videonun piksel boyutunu 800 x 600 ve kare hızını 60 fps olarak ayarlayın.
2. Filtreyi kameranın altından çıkarın, kameranın altına bir cetvel koyun ve ölçek çizgisini net ve video görüş alanının genişliğine paralel hale getirmek için kamera odağını ayarlayın.
3. Yakala'yı tıklayın | Kurulum | Video yakalama kaydetme yolunu seçmek için Kaydı başlat'ı tıklayın, 600 piksele karşılık gelen gerçek mesafeyi kaydedin ve her pikselin gerçek mesafeye oranını hesaplayın.

3. Işıktan kaçınma davranışının video kaydı

1. Tüm deneylerde 25,5 °C'lik bir sıcaklığı koruyun. Gerekirse oda sıcaklığını bir klima ile kontrol edin. Bir nemlendirici ile nemi sürekli olarak %60'ta tutun.
2. "lightarea1" adlı ışık noktası konumunun kısa bir videosunu çekin. Ardından, kamera merceğini kapatmak için 850 nm ± 3 nm filtreyi geri hareket ettirin.
   NOT: Larva davranışını kaydederken, kamera merceği 850 nm ± 3 nm filtre ile kaplanır, böylece ışık noktası videoda gösterilmez. Işık noktası, daha sonra Matlab ile larvalarla videolarda yeniden yapılandırılabilir. Kameranın konumunu değiştirmeyin ve her pikselin oranını adım 2.3'te ölçülen gerçek mesafeye değiştirmekten kaçının.
3. Deney cihazından uzakta bir ışığı (yani bir oda ışığını) açın. Larvalar gözlerle net bir şekilde görülebildiği sürece ışığı mümkün olduğunca azaltın. Larvaları bir kaşıkla kültür ortamından çıkarın, üçüncü bir larvayı nazikçe seçin ve damıtılmış suyla yıkayın. Açlıktan kaynaklanan müdahaleyi önlemek için larvaları birer birer yıkamaya dikkat edin. Tek bir deney en az 20 larva gerektirir.
4. Larvaları, adım 1.3 sırasında kameranın altına yerleştirilen agar plakasının merkezine aktarın. Işığın merceğin altına yansımasını önlemek için larvadaki fazla suyu bir fırça ile nazikçe alın veya larvadaki suyu çıkarmak için kurutma kağıdı kullanın. Oda ışığını kapatın ve larvaların karanlık ortamda 2 dakika alışmasına izin verin.
5. Kızılötesi ışık oluşturmak için LED ışığını açın ve larvaları plakanın ortasına doğru nazikçe fırçalayın. Larva düz bir şekilde sürünmeye başladığında, larvaların ışık noktasına doğru yönelmesini sağlamak için plakayı döndürün. En başından itibaren düz bir şekilde süründüğünden emin olun, aksi takdirde ışık noktasına erişim sağlayamayabilir.
6. Yakala'yı tıklayın | Kurulum | Kaydetme yolunu seçmek için video çekimi, ardından kaydetmek için Kayda başla'yı tıklayın. Larvaların ışık noktasına doğru sürünmesine izin verin, ışık noktasına girin, ardından ışık noktasını neredeyse görüş alanından çıkana kadar bırakın. Kaydı durdur'u tıklayın. Larva yaklaşmadan önce ışık noktasından uzaklaşırsa, doğrudan Kaydı durdur'a tıklayın.
7. Filtreyi kameradan uzaklaştırın. "lightarea2" adlı ışık noktasının konumunun kısa bir videosunu çekin ve ışık noktası konumunun değişmediğinden emin olmak için bunu "lightarea1" ile karşılaştırın. Belirgin bir konum değişikliği gözlemlenirse, verileri atın.

Sonuçlar

Şekil 1: Deney düzeneği. (A) Işık lekesi bazlı larva hızlı fototaksi testi için kurulumun şematik gösterimi. Mavi çizgiler, görsel uyarım olarak kullanılan görünür ışığın yollarını temsil eder ve kırmızı çizgiler, kızılötesi ışığın yollarını temsil eder. Oklar ışığın yönünü gösterir. 850 nm bant geçiren filtre, kızılötesi ışığın geçmesine izin verir, ancak görünür ışığı engeller. (B) Işık...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
850 nm ± 3 nm kızılötesi ışık üreten LED	Thorlabs, Amerika Birleşik Devletleri	PM100A Serisi	Uyumlu Sensörler: Fotodiyot ve Termal Optik Güç Aralığı: 100 pW - 200 W Mevcut Sensör Dalga Boyu Aralığı: 185 nm-25 μm Ekran Yenileme Hızı: 20 Hz Bant genişliği: DC-100 kHz Fotodiyot Sensör Aralığıb: 50 nA-5 mA Termopil Sensör Aralığıb: 1 mV-1 V
AC'den DC'ye dönüştürücü	Thorlabs, Amerika Birleşik Devletleri	S120VC Serisi	Açıklık Boyutu: Ø9.5 mm Dalga boyu aralığı: 200-1100 nm Güç Aralığı: 50 nW-50 mW Dedektör Tipi: Si Fotodiyot (UV Genişletilmiş) Doğrusallık:% ±0,5 < br / > Ölçüm Belirsizliği: %±3 (440-980 nm), %±5 (280-439 nm), %±7 (200-279 nm, 981-1100 nm)
Bant geçiren filtre	Thorlabs, Amerika Birleşik Devletleri	DC2100	LED Akım Aralığı: 0-2 A LED Akım Çözünürlüğü: 1 mA LED Akım Doğruluğu: ±20 mA LED İleri Gerilim: 24 V Modülasyon Frekans Aralığı: 0-100 kHz Sinüs Dalgası Modülasyon: Keyfi
Kolimasyonlu LED mavi ışık	ELP, Çin	USBFHD01M	Çözünürlük: 1920x1080 F6,0 mm Sensör: 1 / 2.7 "CMOS OV2710
Kompakt güç ölçer konsolu	Okyanus Optikleri, ABD	USB2000+(RAD)	Boyutlar: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Ağırlık: 190 g Dedektör: Sony ILX511B (2048 elemanlı doğrusal silikon CCD dizisi) Dalga boyu aralığı: 200-850 nm Entegrasyon süresi: 1 ms – 65 saniye (tipik 20 saniye) Dinamik aralık: 8,5 x 10^7 (sistem); Tek bir satın alma için 1300:1 Sinyal-gürültü oranı: 250:1 (tam sinyal) Karanlık gürültü: 50 RMS sayım Izgara: 2 (250 – 800 nm) Yarık: Yarık-50 Dedektör toplama lensi: L2 Sipariş sıralama: OFLV-200-850 Optik çözünürlük: ~2.0 nm FWHM Dağınık ışık: 600 nm'de %<0,05; 435 nm 'de %<0,10 Fiber optik konektör: SMA 905 - 0.22 sayısal açıklık tek telli fiber
Yüksek Güçlü LED Sürücü	Minhongshi, Çin	MHS-48XY	Çalışma voltajı: DC12V Merkezi dalga boyu: 850nm
Yüksek çözünürlüklü web kamerası	Thorlabs, Amerika Birleşik Devletleri	MWWHL4	Renk: Sıcak Beyaz İlişkili Renk Sıcaklığı: 3000 K Tipik LED Gücü için Test Akımı: 1000 mA Maksimum Akım (CW): 1000 mA Bant genişliği (FWHM): N/A Elektrik Gücü: 3000 mW Görüş Açısı (Tam Açı): 120 ° Verici Boyutu: 1 mm x 1 mm < br / > Tipik Kullanım Ömrü: >50 000 h Çalışma Sıcaklığı (yoğuşmasız): 0 ila 40 °C Depolama Sıcaklığı: -40 ila 70 °C Risk Grubua: RG1 – Düşük Risk Grubu
LED Sıcak Beyaz	Mega-9, Çin	BP850/22K	Ø25.4 (+0 ~ -0.1) mm Bant genişliği: 22±3nm En yüksek geçirgenlik:% 80 < br / > Merkezi dalga boyu: 850nm ± 3nm
Spektrometre	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap, gelişmiş önizleme ve kayıt özelliklerine sahip bir fotoğraf ve video yakalama uygulamasıdır. Windows 7 SP1 veya sonraki sürümleri çalıştıran bilgisayarlar için tasarlanmış bir Masaüstü uygulamasıdır. Windows için Video ve DirectShow uyumlu cihazların çoğu, ucuz web kameraları veya gelişmiş video yakalama kartları olsun, desteklenir.
Standart fotodiyot güç sensörü	Süper Ejderha, Çin	YGY-122000	Giriş: AC 100-240V ~ 50 / 60Hz 0.8A < br / > Çıkış: DC 12V 2A
Termal güç sensörü	Thorlabs, Amerika Birleşik Devletleri	M470L3-C1	Renk: Mavi Nominal Dalga Boyu: 470 nm Bant genişliği (FWHM): 25 nm Maksimum Akım (CW): 1000 mA İleri Gerilim: 3.2 V Elektrik Gücü (Maks): 3200 mW Verici Boyutu: 1 mm x 1 mm < br / > Tipik Kullanım Ömrü: 100 000 h Çalışma Sıcaklığı (yoğuşmasız): 0 ila 40 °C Depolama Sıcaklığı: -40 ila 70 °C Risk Grubub: RG2 – Orta Risk Grubu
Termal güç sensörü	Thorlabs, Amerika Birleşik Devletleri	S401C Serisi	Dalga boyu aralığı: 190 nm-20 μm Optik güç aralığı:10 μW-1 W(3 Wb) Giriş açıklığı boyutu: Ø10 mm Aktif dedektör alanı: 10 mm x 10 mm Maksimum optik güç yoğunluğu: 500 W/cm2 (Ort.) Doğrusallık: %±0,5

Serisi Serisi Serisi Serisi