Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
3.9K görüntüleme
⸱
30 Nisan 2023
Kaynak: Imura, E., et al. Meyve Sineği Drosophila melanogaster'da İmmün Boyama ile Steroidojenik Organları ve Etkileşimli Organlarını Görselleştirme Protokolleri. J. Vis. Uzm. (2017).
Bu video, ekdisteroidlerin ve diğer hormonların biyosentezi ve salgılanması için önemli olan karmaşık bir endokrin yapı olan Drosophila halka bezini tanımlar. Özellikli protokol diseksiyonunu, fiksasyonunu ve immün boyamayı gösterir.
Bu protokol, Imura ve ark., Meyve Sineği Drosophila melanogaster'de İmmünoboyama ile Steroidojenik Organları ve Etkileşimli Organlarını Görselleştirme Protokollerinden bir alıntıdır, J. Vis. Exp. (2017).
NOT: Protokollerin genel şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Larva Halka Bezinin Diseksiyonu (RG)
NOT: Cyclorrhaphous Diptera'ya ait olan D. melanogaster'da PG, halka bezi adı verilen kompozit bir endokrin organ içindedir (RG, Şekil 2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Şekil 1: Protokollerin genel şeması. Deneylerin amacına bağlı olarak larvalara ve yetişkin dişilere iki farklı diseksiyon yöntemi uygulanabilir. Montaj yöntemleri de numune koşullarına göre tasarlanır. Fiksasyon, boyama ve görüntüleme teknikleri temel olarak tüm numuneler için ortaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Yumurta toplama | |||
| Doku kültürü kabı (55 mm) | TEK OLARAK | 1-8549-02 | üzüm suyu agar tabakları için |
| Toplama kabı | HIKARI KAGAKU | ||
| maya macunu | Oryantal kuru maya, Tokyo | ||
| %100 üzüm suyu | Welch Gıda A.Ş. | ||
| Yetiştirme larvaları | |||
| küçük şişeler (12ml, 40×23,5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| Tek Kullanımlık Döngü | TEK OLARAK | 6-488-01 | |
| Standart sinek yemi | Tarif, Bloomington stok merkezinin web sitesinde yer almaktadır. | ||
| Diseksiyonu | |||
| diseksiyon mikroskobu | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| diseksiyon mikroskobu | Leica Belediyesi | S8 AP0 | |
| Doku kültürü kabı (35 x 10 mm, işlem görmemiş) | IWAKI BELEDIYESI | 1000-035 | |
| Sylgard Belediyesi | TORAY | Bulaşıkların içindeki silikonu birleştirmek | |
| Terumo iğnesi (27G, 0,40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | Dokuyu kesmek için bir "bıçak" |
| forseps, Inox, #5 | Dumont, İsviçre | ||
| Böcek pimi (0,18 mm çapında) | Shiga Markası | fileto diseksiyonu için | |
| Mikro Makas | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| Fiksasyon | |||
| Ultra saf su | Merck Kırlangıç | ||
| fosfat tamponlu salin (PBS) | |||
| Formaldehit | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehit | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Mikrotüpler (1.5 miL) | İNA OPTIKA | CF-0150 | |
| Kuluçka | |||
| Bir swist mikser TM-300 (rocker) olarak | Biri olarak | TM-300 | Rocker |
| Sığır Serumu Albümini | Sigma | 9048-46-8 | |
| Birincil antikor | |||
| anti-Sro (kobay), 1:1000 | |||
| anti-GFP (tavşan), 1:1000 | Moleküler Problar | A6455 | Shimada-Niwa ve Niwa, 2014 |
| anti-GFP (fare mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (tavşan), 1:500 | Sigma | S5545 Serisi | |
| anti-Hts 1B1 (fare) | Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (sıçan), 1:20 | DSHB (Türkçe) | DCAD2 | |
| Anti-NC82 (fare), 1:50 | DSHB (Türkçe) | NC82 | |
| İkincil antikor | |||
| Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjugatı | Yaşam Teknolojileri | A-11008 | |
| Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjugatı | Yaşam Teknolojileri | A-11001 | |
| Keçi anti-sıçan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 546 konjugat | Yaşam Teknolojileri | A-11081 | |
| Keçi anti-Gine Domuzu IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 555 konjugat | Yaşam Teknolojileri | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 boya konjuge falloidin | Yaşam Teknolojileri | A-22283 | |
| Montaj reaktifleri | |||
| Mikro sürgülü cam | Matsunami Cam San., Ltd. | SS7213 | |
| Kare mikroskop kapak camı | Matsunami Cam San., Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reaktifi (Montaj reaktifi) | Calbiochem (Kireç Biyokimyası | 345789 | |
| Transfer pipeti 1 ml (Tek kullanımlık damlalık) | Watson | 5660-222-1S | |
| Hisse senetlerini uçurun | |||
| bir; GMR45C06-GAL4 | Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden. (#46260) | ||
| UAS-GFP; UAS–mCD8::GFP | Tokyo Üniversitesi'nden K. Ito'dan hediyeler. | ||
| w[1118] | |||
| w; hayalet-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| bir; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Li, H. H. (2014) ve Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| bir; UAS-mCD8::GFP | Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden. (#51941) |
