Larva Halka Bezi Diseksiyonu: Gelişimsel Endokrin Organların Drosophila'dan İzolasyonu

Özet

Kaynak: Imura, E., et al. Meyve Sineği Drosophila melanogaster'da İmmün Boyama ile Steroidojenik Organları ve Etkileşimli Organlarını Görselleştirme Protokolleri. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, ekdisteroidlerin ve diğer hormonların biyosentezi ve salgılanması için önemli olan karmaşık bir endokrin yapı olan Drosophila halka bezini tanımlar. Özellikli protokol diseksiyonunu, fiksasyonunu ve immün boyamayı gösterir.

Protokol

Bu protokol, Imura ve ark., Meyve Sineği Drosophila melanogaster'de İmmünoboyama ile Steroidojenik Organları ve Etkileşimli Organlarını Görselleştirme Protokollerinden bir alıntıdır, J. Vis. Exp. (2017).

NOT: Protokollerin genel şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Larva Halka Bezinin Diseksiyonu (RG)

NOT: Cyclorrhaphous Diptera'ya ait olan D. melanogaster'da PG, halka bezi adı verilen kompozit bir endokrin organ içindedir (RG, Şekil 2D). PG'nin diğer hücre tiplerinden cerrahi olarak ayrılması mümkün olmadığından (daha sonra tartışılacaktır), pratik bir hedef, sağlam, hasarsız bir RG'yi diseksiyon ile izole etmektir.

1. Larvaların uygun gelişim aşamalarında hazırlanması
   NOT: D. melanogaster larvalarının gelişim aşamalarını senkronize etmek için dar bir zaman aralığı içinde yumurta toplamak ve larvaları uygun zamanlarda toplamak gerekir.
   1. Yumurtaları 25 ° C'de üzüm suyu agar tabağında 2 saat boyunca toplayın.
   2. Forseps ile diseksiyon mikroskobu altında yumurtadan yeni çıkmış 1. instar larvalarını toplayın ve bunları püre haline getirilmiş standart maya/mısır unu sineği yemi içeren küçük bir şişeye aktarın.
      NOT: Larvaların yaşı "yumurtlamadan sonraki saatler (hAEL)", "yumurtadan sonraki saatler (hAH)" veya "L3 ekdizinden sonraki saatler (hAL3E)" ile temsil edilir.
   3. Uygun zaman noktasında, istenmeyen yaralanmaları önlemek için aşamalı larvaları tek kullanımlık plastik bir halka ile toplayın. 3^{. instar} larvalarının gelişimsel ilerlemesindeki farkı en aza indirmek için, 2^{. instar} larvalarını 70 hAEL'de (48 hAH) toplayın ve 2 saatlik aralıklarla tüy dökmelerine izin verin. Daha sonra, L3 ekdizinden sonraki 2 saat içinde 3^{. instar} larvalarını toplayın; bu işlem 0-2 hAL3E larvalarını verir.
   4. Aşamalı larvaları fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş bir tabağa aktarın.
   5. Kalan yiyecekleri vücuttan çıkarmak için larvaları PBS ile durulayın.
2. Diseksiyon mikroskobu altında larvaların kaba diseksiyonu
   1. Bir larvanın ağız kancasını forseps ile tutun. Larva gövdesini mikro makas kullanarak vücut uzunluğunun üçte biri kadar ön kısımdan kesin.
   2. Ön larva gövdesinin kesik ucunu bir çift forseps ile tutun. Diğer forseps çiftini kullanarak, başın ucunu yavaşça vücudun içine doğru itin; Bu prosedür larva gövdesini ters çevirir.
      NOT: 1. instar larvalarının diseksiyonu için bu adım atlanabilir.
   3. 1.2.1-1.2.2 adımlarını ek larvalarla 5-10 dakika boyunca tekrarlayın.
      NOT: Diseksiyon için zaman kazanmak için larva sayısı 20'ye eşit veya daha az olmalıdır.
3. İmmünohistokimya ile dokunun fiksasyonu ve boyanması
   1. Larva cisimlerinin ön üçte birini (adım 1.2.2), 500 μL sabitleme solüsyonu (PBS'de% 4 paraformaldehit) ile doldurulmuş 1.5 mL'lik bir mikrotüpe koyun. Bir seferde 20'den az numuneyi sabitleyin, aksi takdirde sabit numunelere bağlı PBS, fiksatifin olumsuz bir şekilde seyreltilmesine neden olabilir. Fileto diseksiyonu için bir damla PBS'yi çıkarın ve ardından bir damla düzeltme solüsyonu ekleyin.
      NOT: Fiks çözeltisi için% 3.7 formaldehit veya% 4 paraformaldehit kullanılabilir.
   2. Diseke edilen dokuları fiks solüsyonunda oda sıcaklığında (RT) 30 dakika veya alternatif olarak 4 ° C'de 2 saat inkübe edin.
   3. Sabitleme solüsyonunu 500 μL PBS ile değiştirin ve numuneleri 3 kez hızlıca durulayın. Numuneleri 500 μL %0.3 PBT (PBS + %0.3 oktilfenol etoksilat) ile RT'de bir külbütörde 15 dakika yıkayın. Fileto diseksiyonu için böcek pimlerini çıkarın ve numuneleri 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
      NOT: Antikorların dokulara geçirgenliğini arttırmak için, numuneler RT'de bir külbütör üzerinde 1-2 saat boyunca 500 μL% 2.0 PBT ile muamele edilir.
   4. PBT'yi 500 μL bloke edici solüsyonla değiştirin (PBT'de% 2 sığır serum albümini). Numuneleri RT'de bir külbütör üzerinde 1,5 saat inkübe edin.
   5. Bloke etme solüsyonunu 50 μL birincil antikor solüsyonu, yani bloke edici solüsyon içinde seyreltilmiş antikorlar ile değiştirin.
   6. Numuneleri gece boyunca 4 °C'de bir külbütör üzerinde inkübe edin.
   7. Birincil antikor çözeltisini 500 μL% 0.3 PBT ile değiştirin ve örnekleri 5 kez hızlı bir şekilde durulayın. Numuneleri 500 μL% 0.3 PBT ile her biri RT'de bir külbütörde 15 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
   8. % 0.3 PBT'yi 50 μL ikincil antikor çözeltisi (bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş boya konjuge antikorlar) ile değiştirin. Nükleer boyama için 50 μL çözeltiye 0.5 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0.1 mg/mL stok çözeltisi) eklenir. Numuneleri RT'de 2 saat veya alternatif olarak gece boyunca 4 °C'de bir külbütör üzerinde inkübe edin.
      NOT: Numuneleri karanlıkta tutun.
   9. Antikor solüsyonunu 500 μL% 0.3 PBT ile değiştirin ve 5 kez durulayın. Numuneleri RT'de her biri 15 dakika boyunca 500 μL% 0.3 PBT ile 3 kez yıkayın.
4. PG içeren beyin-RG kompleksinin ince diseksiyonu ve montajı
   1. İmmün lekeli numuneleri %0,3 PBT ile doldurulmuş bir tabağa aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın.
      NOT: Diseksiyon ve montaj sırasında rahatsız edici kabarcıkları önlemek için,% 0.3 PBT PBS ile değiştirilebilir.
   2. Diseksiyon mikroskobu altında, kütikülü veya ağız kancasını bir çift forseps ile tutun. 1 mL'lik bir şırıngaya "bıçak" olarak bağlı 27 G'lik bir iğne kullanarak, beyin-RG-göz diski kompleksini vücut kütikülünden çıkarmak için yemek borusunun ve göz disklerinin ön ucunu kesin.
   3. Yemek borusunu ve bağırsağı forseps ile beyin-RG-göz diski kompleksinden ayırın. Yemek borusu beyinden ventral sinir kordonunun (VNC) üzerinden geçtiğinden, bağırsağı arka tarafa doğru çekin.
      NOT: Örneklerden ekstra hayali diskleri çıkarmak için beyin, göz diskleri ve bacak diskleri arasındaki bağlantıları bir iğne bıçağıyla kesin.
   4. Diğer örnekler için 1.4.1-1.4.4 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Doku kalıntılarının numunelere yapışmasını önlemek için, tamamlanan her numuneyi %0,3 PBT veya PBS ile doldurulmuş farklı bir temiz kaba aktarın.
   5. Numuneleri bir mikropipet ile temiz bir cam sürgünün ortasına aktarın.
      NOT: 2^. veya 3. instar larvalar için mikropipet ucunun ucu jiletle kesilmelidir.
   6. Diseksiyon mikroskobu altında, forseps kullanarak tek tek numuneleri sırt tarafları yukarı bakacak şekilde hizalayın.
      NOT: RG beynin dorsal tarafında bulunur (Şekil 2A). Bu hizalama, görüntüleme sırasında tek tek numunelerin spesifikasyonunu kolaylaştırır.
   7. Bir cam sürgüyü eğin ve mümkün olduğunca fazla PBT'yi silin. Sürgünün bir tarafına bir damla montaj reaktifi koyun. Damlanın diğer tarafından bir kapak fişinin kenarını yerleştirin ve kapak fişini forseps ile yavaşça numunelerin üzerine koyun.
      NOT: Bu prosedür, numunelerin kapak kızağının dışına çıkmasını önler.
   8. Numuneleri 4 °C'de saklayın. Numuneleri karanlıkta tutun.

Sonuçlar

Şekil 1: Protokollerin genel şeması. Deneylerin amacına bağlı olarak larvalara ve yetişkin dişilere iki farklı diseksiyon yöntemi uygulanabilir. Montaj yöntemleri de numune koşullarına göre tasarlanır. Fiksasyon, boyama ve görüntüleme teknikleri temel olarak tüm numuneler için ortaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yumurta toplama
Doku kültürü kabı (55 mm)	TEK OLARAK	1-8549-02	üzüm suyu agar tabakları için
Toplama kabı	HIKARI KAGAKU
maya macunu	Oryantal kuru maya, Tokyo
%100 üzüm suyu	Welch Gıda A.Ş.
Yetiştirme larvaları
küçük şişeler (12ml, 40×23,5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
Tek Kullanımlık Döngü	TEK OLARAK	6-488-01
Standart sinek yemi			Tarif, Bloomington stok merkezinin web sitesinde yer almaktadır.
Diseksiyonu
diseksiyon mikroskobu	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
diseksiyon mikroskobu	Leica Belediyesi	S8 AP0
Doku kültürü kabı (35 x 10 mm, işlem görmemiş)	IWAKI BELEDIYESI	1000-035
Sylgard Belediyesi	TORAY		Bulaşıkların içindeki silikonu birleştirmek
Terumo iğnesi (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	Dokuyu kesmek için bir "bıçak"
forseps, Inox, #5	Dumont, İsviçre
Böcek pimi (0,18 mm çapında)	Shiga Markası		fileto diseksiyonu için
Mikro Makas	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fiksasyon
Ultra saf su	Merck Kırlangıç
fosfat tamponlu salin (PBS)
Formaldehit	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehit	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
Mikrotüpler (1.5 miL)	İNA OPTIKA	CF-0150
Kuluçka
Bir swist mikser TM-300 (rocker) olarak	Biri olarak	TM-300	Rocker
Sığır Serumu Albümini	Sigma	9048-46-8
Birincil antikor
anti-Sro (kobay), 1:1000
anti-GFP (tavşan), 1:1000	Moleküler Problar	A6455	Shimada-Niwa ve Niwa, 2014
anti-GFP (fare mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (tavşan), 1:500	Sigma	S5545 Serisi
anti-Hts 1B1 (fare)	Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (sıçan), 1:20	DSHB (Türkçe)	DCAD2
Anti-NC82 (fare), 1:50	DSHB (Türkçe)	NC82
İkincil antikor
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjugatı	Yaşam Teknolojileri	A-11008
Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjugatı	Yaşam Teknolojileri	A-11001
Keçi anti-sıçan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 546 konjugat	Yaşam Teknolojileri	A-11081
Keçi anti-Gine Domuzu IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 555 konjugat	Yaşam Teknolojileri	A-21435
Alexa Fluor 546 boya konjuge falloidin	Yaşam Teknolojileri	A-22283
Montaj reaktifleri
Mikro sürgülü cam	Matsunami Cam San., Ltd.	SS7213
Kare mikroskop kapak camı	Matsunami Cam San., Ltd.	C218181
FluorSave reaktifi (Montaj reaktifi)	Calbiochem (Kireç Biyokimyası	345789
Transfer pipeti 1 ml (Tek kullanımlık damlalık)	Watson	5660-222-1S
Hisse senetlerini uçurun
bir; GMR45C06-GAL4			Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden. (#46260)
UAS-GFP; UAS–mCD8::GFP			Tokyo Üniversitesi'nden K. Ito'dan hediyeler.
w[1118]
w; hayalet-GAL4#22/UAS-turboRFP
bir; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) ve Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
bir; UAS-mCD8::GFP			Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden. (#51941)