Bu protokol, Chattopadhyay ve ark., Drosophila Larvalarında Termal Nosisepsiyonun Değerlendirilmesinin Yerel ve Küresel Yöntemleri, J. Vis. Exp. (2012).
1. Lokal Isı Probu Testi
Pro-Dev Engineering tarafından üretilen özel yapım bir termal prob kullanarak tek bir larva vücut segmentine zararlı bir termal uyaran veriyoruz (bkz. malzeme tablosu). Bu prob optimum tasarım özelliklerine sahip olmasına rağmen (~ .07mm2 alanlı küçük bir metal uç ve 23 °C ila 65 °C arasında bir ayar noktası sıcaklığını hassas bir şekilde koruma yeteneği), prensip olarak, 20 saniyeye kadar bir süre boyunca belirli bir sıcaklığa ısıtılabilen küçük bir uca sahip herhangi bir alet yeterli olmalıdır. Prob ucu, abdominal segment A4'te dorsal orta hatta hassas bir şekilde erken 3. instar larvaları uyarmak için kullanılır (bkz. <strong class="xfig">Şekil 1). Bu termal uyarana yanıt olarak, larvalar genellikle yanal olarak 360 derece veya daha fazla yuvarlanma gibi caydırıcı bir geri çekilme davranışı sergileyecektir. Bu davranış, genellikle lokomotor aktivitelerinde kısa bir duraklama içeren, zararlı olmayan bir oda sıcaklığındaki metal proba verdikleri hafif dokunma tepkisinden farklıdır.
Isı probu tahlili için
Protokolü:
- Termal probun istenen ayar noktasına önceden ayarlanmış sıcaklığı.
- Tek bir larvayı daha sonra uyarılacak olan düz bir platforma (genellikle bir bağlayıcıdan kesilmiş küçük bir vinil parçası kullanırız) nazikçe aktarmak için bir boya fırçası veya forseps kullanın. Larva, termal prob ile temastan önce ince bir su tabakası ile kaplanmalıdır. Larvaları kaplayan su filmi mümkün olduğunca az olmalı ve larvaları tamamen örtmeli, aynı zamanda vinile dokunduğunda larvaların kuru olmamasını sağlamalıdır.
- Prob ucunu A4 segmentindeki larvaya doğru hafifçe bastırın ve uç ile prob ile larva yüzeyi arasında yaklaşık 45°'lik bir açıyla hafif basınç uygulayın (bkz. Şekil 1). Basınç, larva yüzeyinde hafif bir girintiye neden olmalı ve genellikle hareketi önlemek için yeterli olacaktır. Larva hareket etmeye devam ederse, biraz daha fazla baskı uygulayın ve genellikle duracaktır. Görüş alanının dışına çıkan veya yanıt veya 20 sn kesilmeye kadar sürekli prob teması sağlanamayan larvalardan gelen verileri kaydetmeyin.
- Hangisi önce gerçekleşirse, bir geri çekilme tepkisi sergilenene veya 20 saniyelik kesmeye ulaşılana kadar larvaları uyarmaya devam edin. Yanıt veren larvalar tipik olarak ilk önce baş ve kuyruğu kaldırmak için bir ön davranış gösterir. Bunu genellikle en az 360 derece yuvarlanmanın geri çekilme davranışı takip eder. Gözlem davranışı olarak yalnızca 360 derecelik tam bir rulo puanlanır (ön baş veya kuyruk yükseltmesi değildir).
- Para çekme davranışı başlatıldıktan sonra, prob ile teması bırakın ve gecikmeyi veya geri çekilme süresini kaydedin. 20 saniye içinde herhangi bir geri çekilme davranışı gözlenmezse, larva yanıt vermez. Yanıtlayıcılar ayrıca 2 kategoriye ayrılabilir. Geri çekilme davranışı 5 saniye içinde gösterilirse, larva hızlı yanıt verir. Geri çekilme davranışı 5-20 saniye arasında gösteriliyorsa, larva yavaş yanıt veren bir kişidir (bkz. Şekil 1, Babcock ve ark., Curr. Biol. (2009)).
