Sıcaklık Gradyanı Deneyi: Drosophila Larvalarında Sıcaklık Tercihini Test Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Liu, J., et al. Drosophila Larvalarının Termal Tercihlerini Belirlemek İçin Bir Sıcaklık Gradyanı Deneyi. J. Vis. Uzm. (2018).

>Drosophila meyve sinekleri, sıcaklıktaki küçük değişiklikleri ayırt edebilir ve bu nedenle uygun termal koşullara sahip ortamları seçebilir. Bu video, Drosophila larvalarının sıcaklık tercihini doğrusal bir termal gradyan üzerinde test eden davranışsal bir testi açıklamaktadır.

Protokol

Bu protokol Liu ve ark.'dan bir alıntıdır. Drosophila Larvalarının Termal Tercihlerini Belirlemek İçin Bir Sıcaklık Gradyanı Deneyi, J. Vis. Exp. (2018).

1. Sıcaklık Gradyanı Kurulumu

1. Tek yönlü gradyan hazırlama
   1. Tahliller sırasında nemli bir ortam yaratmak için, iki su banyosuna bağlı iki alüminyum bloğu 10 cm arayla ıslak kağıt havluların üzerine yerleştirin (Şekil 1A).
   2. Alüminyum blokların sıcaklığının dengelenmesi için yeterli zaman tanımak için tahlili başlatmadan ~ 2 saat önce iki su banyosunu açın.
      NOT: İstenen doğrusal sıcaklık gradyanını elde etmek için gerekli olan her bir su banyosunun sıcaklığını belirlemek için sahte bir deney yapılması önerilir. Su banyolarını ayarlamak için bazı tipik sıcaklık çiftleri Tablo 1'de listelenmiştir. Ancak, yüzey sıcaklıklarının ortam sıcaklığından etkilendiğini unutmayın. Borularda soğutma olduğu için borunun uzunluğu da sıcaklıkları etkiler. Kurulumumuzdaki borunun uzunluğu 1,5 m'dir.
   3. 500 mL'lik yuvarlak geniş ağızlı bir şişede yüksek güç ayarında 100 mL% 1 agarozu mikrodalgada pişirin ve düz bir tezgah üzerine 25 mL / tahlil plakası dökün. Alüminyum bloklara aynı anda yerleştirilebilecek iki tahlil plakası hazırlayın (Şekil 1A).
   4. Agaroz katılaştıktan sonra (10-20 dakika), agaroz yüzeyini hafif kaba hale getirmek için her bir agaroz yüzeyini standart bir mutfak süngeri veya melamin sünger ile nazikçe ovalayın, böylece agaroz jeli üzerine su püskürtülürken pürüzsüz ince bir su zarı oluşturulacak ve su damlacıkları oluşmayacaktır.
   5. Plakaların kurumasını önlemek için tahlil yapılmaya hazır olana kadar plakaları damıtılmış su içeren bir kaba tamamen daldırın.
2. Çift yönlü degrade hazırlama (isteğe bağlı)
   1. Tahliller sırasında nemli bir ortam oluşturmak için, ıslak kağıt havluların üzerine 8 cm aralıklarla (Şekil 1B) üç alüminyum blok yerleştirin.
   2. Alüminyum blokların sıcaklığının dengelenmesi için yeterli zaman tanımak için tahlili başlatmadan ~ 2 saat önce iki su banyosunu açın.
      NOT: Çift yönlü gradyan için her bir su banyosunun sıcaklığını belirlemek için sahte bir deney yapılması önerilir. Su banyolarını ayarlamak için bazı tipik sıcaklık çiftleri Tablo 2'de listelenmiştir. Ancak, yüzey sıcaklıklarının ortam sıcaklığından etkilendiğini unutmayın. Borularda soğutma olduğu için borunun uzunluğu da sıcaklıkları etkiler. Kurulumumuzdaki borunun uzunluğu 1,5 m'dir.
   3. Agarozun plakadan dökülmesini önlemek için, alüminyum plakanın kenarlarını 10 mm yüksekliğinde bir duvar oluşturacak şekilde etiketleme bandı ile sarın (Şekil 1B).
   4. Yüksek güç ayarını kullanarak, 500 mL'lik yuvarlak geniş ağızlı bir şişede 200 mL% 1 agarozu mikrodalgada pişirin ve 120 mL'yi bir tahlil plakasına dökün.
   5. Agaroz katılaştıktan sonra (~ 30 dakika), agaroz yüzeyini hafif kaba hale getirmek için her bir agaroz yüzeyini standart bir mutfak süngeri veya melamin sünger ile nazikçe ovalayın, böylece agaroz jeli üzerine su püskürtülürken pürüzsüz ince bir su zarı oluşur ve su damlacıkları oluşmaz.
   6. Kurumasını önlemek için tahlil plakalarını tahlil yapılmaya hazır olana kadar damıtılmış su içeren bir kaba tamamen daldırın.
3. Tek yönlü gradyanı ayarlama
   1. Degrade tahlil aparatının yanındaki bir tezgahta reaktifleri ve öğeleri hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Verimli sıcaklık transferini teşvik etmek için, bloklar ve plaka arasındaki arayüze su püskürterek alüminyum bloklar ve test plakaları arasındaki boşlukları doldurun.
   3. Eldiven kullanarak tahlil plakalarını su kabından çıkarın. Agaroz jeli ile plaka arasına su girerse ve yüzeyde çıkıntılar oluşmasına neden olursa, suyu bir P1000 mikropipet ile çıkarın.
   4. Tahlil plakalarını, her iki kenardan 2 cm uzaklıktaki çıkıntılar alüminyum blokların kenarlarıyla tam olarak eşleşecek şekilde alüminyum blokların üzerine yerleştirin (Şekil 1A,C).
   5. Agaroz jelinin kurumasını önlemek için plakanın yüzeyine su püskürtün (agaroz yüzeyini kaplayan ince bir su zarı yeterlidir). Larvalar su damlacıklarında sıkışıp kalabileceğinden, su zarının sürekli olduğundan ve su damlacıklarından arınmış olduğundan emin olun.
   6. Suyun buharlaşmasını azaltmak ve jel yüzeyinin sıcaklığını stabilize etmeye yardımcı olmak için gradyan sistemini bir karton kutu ile örtün. Sıcaklığın dengelenmesi için 5-10 dakika bekleyin.
   7. Plaka üzerindeki 12 noktada yüzey sıcaklığını kontrol edin (Şekil 1C). Bir bölge içinde değişkenlik olup olmadığını belirlemek için her bölge içinde iki ölçüm yapın. Her iki noktadaki sıcaklığın istenen sıcaklığın ± 0.2 °C arasında olduğundan emin olun.
      NOT: Bir bölge içindeki değişkenlik genellikle, iki noktanın alüminyum blokların kenarına olan tam mesafeleri aynı olmadığı için oluşur. Her iki kenardan 2 cm uzaklıktaki çıkıntıların alüminyum blokların kenarlarıyla tam olarak eşleştiğinden emin olmak için plakanın alüminyum bloklar üzerindeki konumunu ayarlayın.
   8. Ölçülen sıcaklık gradyanı istenen gradyandan saparsa, su banyosu sıcaklık ayar(lar)ını artırın veya azaltın ve su banyosunun/banyolarının sıcaklığı stabilize olduktan sonra yüzey sıcaklığını yeniden kontrol edin.
   9. Tahlil başlayana kadar gradyan sistemini bir karton kutu ile örtün.
4. Çift yönlü gradyanı ayarlama (isteğe bağlı)
   1. Degrade tahlil aparatının yanındaki bir tezgahta reaktifleri ve öğeleri hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Yüzeyler arasındaki boşlukları doldurarak alüminyum bloklardan tahlil plakalarına verimli sıcaklık transferini teşvik etmek için üç alüminyum bloğun yüzeylerine su püskürtün.
   3. Tahlil plakalarını su kabından dikkatlice çıkarın ve alüminyum blokların üzerine yerleştirin. Agaroz jeli ile plaka arasına su girerse ve bu da yüzeyde tümseklerin oluşmasına neden olabilirse, suyu bir P1000 mikropipet ile çıkarın.
   4. Tahlil plakasını alüminyum blokların üzerine, her iki kenardan gelen birinci ve son bölgelerin orta çizgileri iki yan alüminyum bloğun kenarlarıyla tam olarak eşleşecek şekilde yerleştirin (Şekil 1B,D).
   5. Agaroz jelinin kurumasını önlemek için plakanın yüzeyine su püskürtün (agaroz yüzeyini kaplayan ince bir su zarı yeterlidir). Larvalar su damlacıklarında sıkışıp kalabileceğinden, su zarının sürekli olduğundan ve su damlacıklarından arınmış olduğundan emin olun.
   6. Suyun buharlaşmasını azaltmak ve jel yüzeyinin sıcaklığını stabilize etmeye yardımcı olmak için gradyan sistemini bir karton kutu ile örtün. Sıcaklığın dengelenmesi için 5-10 dakika bekleyin.
   7. 10 bölgenin her birinin orta çizgisi boyunca iki noktada yüzey sıcaklığını kontrol edin (Şekil 1D). Bir bölge içinde değişkenlik olup olmadığını belirlemek için her bölge içinde iki ölçüm yapın. Her iki noktadaki sıcaklığın istenen sıcaklığın ± 0.2 °C arasında olduğundan emin olun.
      NOT: Bir bölge içindeki değişkenlik genellikle, iki noktanın alüminyum blokların kenarına olan tam mesafeleri aynı olmadığı için oluşur. Her bir kenara en yakın ilk ve son bölgelerin orta çizgilerinin iki yan alüminyum bloğun kenarlarıyla tam olarak eşleştiğinden emin olmak için plakanın alüminyum bloklar üzerindeki konumunu ayarlayın.
   8. Ölçülen sıcaklık gradyanı istenen gradyandan saparsa, su banyosu sıcaklık ayar(lar)ını ayarlayın ve su banyosunun/banyolarının sıcaklığı stabilize olduktan sonra yüzey sıcaklığını yeniden kontrol edin.
   9. Testin başlangıcına kadar blokları bir karton kutu ile örtün.

2. Tahlil ve Hesaplama

1. Karton kutuyu çıkarın ve larvaları plakaya aktarmadan hemen önce jel yüzey sıcaklığını kontrol edin. Sıcaklık dengesinin bozulmasını önlemek için karton kutunun açık kaldığı süreyi en aza indirin. Yüzey kuruysa, yüzeye az miktarda su püskürtün.
2. Tek yönlü gradyan ±(serbest bırakma bölgesi; Şekil 1C).
   NOT: Çift yönlü gradyan için, her bir yarının orta bölgesi boyunca 200-400 larva dağıtın (Şekil 1D).
3. Larvaların dışarı çıkmasını önlemek için her tahlil plakasının üzerine bir mikroplaka kapağı yerleştirin. Işığa maruz kalmayı önlemek için kurulumu bir karton kutu ile örtün, bu da agaroz jeli üzerindeki larva seçimini etkileyebilir.
   NOT: Çift yönlü gradyan için, plakayı bir kapakla örtmek gerekli olmamalıdır, çünkü plaka daha büyüktür ve larvaların tercih edilen sıcaklığı orta bölgededir. Sonuç olarak, az sayıda larva kenarlarda birikir ve dışarı çıkma fırsatı bulur.
4. Larvaların yaşına bağlı olarak, testin tek yönlü gradyan için 10-30 dakika ve çift yönlü gradyan için 15-35 dakika devam etmesine izin verin (Tablo 3).
5. Karton kutuyu ve mikroplaka kapağını çıkarın. Bir dijital kamera kullanarak plakaları yukarıdan fotoğraflayın. Araştırmacının analiz için daha iyi kontrast ve parlaklığa sahip olanı seçebilmesi için her tahlil plakasının iki fotoğrafını çekin.
6. Tüm larvaları tahlil plakalarından ve plakaların dışındaki herhangi bir yerden aspirasyon ile çıkarın.
7. Tahlil plakalarını, tüpleri ve hücre süzgecini damıtılmış su ile iyice temizleyin. Agarozun yüzeyi zarar görmedikçe o gün hazırlanan tahlil plakalarını tekrar kullanın.
8. Her bölgedeki larvaların yüzde dağılımını hesaplayın.
   1. Görüntüye işaretler eklemeye izin veren herhangi bir yazılımı kullanarak tahlil sonuçlarının fotoğrafik görüntüsünü açın. Tahlil bölgelerini belirtmek için, tahlil plakasındaki sınırlara göre her 2 cm'de bir dikey çizgiler çizin.
   2. Her bölgedeki larva sayısını sayın ve sayıları kaydedin. Duvarların hiçbirinden 0,5 cm uzaklıktaki bölgelerde larvaları saymayın. Jel duvarların yakınında daha kalındır ve bu bölgelerde yüzey sıcaklıkları doğrusal değildir.
   3. Tek yönlü gradyan için, her bölgedeki yüzde dağılımını aşağıdaki gibi hesaplayın:
      (belirli bir 2 cm'lik bölgedeki larva sayısı)/ (6 bölgedeki toplam larva sayısı) x 100.
   4. Çift yönlü gradyan için, her bölgedeki yüzde dağılımını aşağıdaki gibi hesaplayın:
      (belirli bir 2 cm'lik bölgedeki larva sayısı)/ (gradyanın her iki tarafındaki 5 bölgedeki toplam larva sayısı) x 100.

Sonuçlar

Şekil 1: Tek ve çift yönlü gradyan tahlil kurulumları. (A) İki alüminyum blok üzerinde iki alüminyum tahlil plakası ile tek yönlü gradyan kurulumu. Alüminyum blokların sıcaklıkları, iki su banyosundan su sirkülasyonu ile kontrol edilir. (B) Çift yönlü bir gradyan için üç alüminyum bloğun, su banyolarının ve bir alüminyum plakanın (250 x 220 mm) düzenlenmesi. Sol ve sağ bloklar aynı su ban...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gradyan tahlil aparatı
PolyScience 9106, Soğutmalı/Isıtmalı 6L Sirkülasyon Banyosu	Thomas Bilimsel	9106	Bu modelin üretimi durduruldu. Güncellenen yedek modeller şunları içerir: 120 V, 60 Hz veya 1184L08 için 1186R00 ve 1197U04 ve 240 V, 50 Hz için 1197U04.
Alüminyum tahlil plakası (tek yönlü gradyan için)			Dış boyut: 14 x 10.1 x 0.9 cm, iç boyut: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, siyah eloksallı.
Alüminyum levha (çift yönlü gradyan için)			25 x 22 x 0,2 cm, siyah eloksallı.
Alüminyum blok			Dış boyut: 25,5 x 5 x 1,4 cm, iç kanalların parametreleri Şekil 1D'de gösterilmiştir.
Alüminyum bloklar ve borular için konektör	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sıhhi Silikon Boru	Tygon Gölü	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" duvar
ad	şirket	Katalog Numarası	Yorum
Test için öğeler ve reaktifler
Havaneli	ABD Bilimsel	17361	1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri için havaneli
termometre	Tesadüftü	51II
Termokupl	Tesadüftü	K türü
Üniversal mikroplaka kapağı	Corning	6980A77
35 mm çanak	Corning	9380D40
Etiketleme bandı (çift yönlü gradyan için)	Balıkçı Bilimsel	15-951	Fisherbrand etiketleme bandı 2 inç x 14 yds
agaroz	Canlandırıcı	16500500	% 1 çözelti hazırlayın
Sakaroz	Sigma	S0389-5KG	Tahlillere başlamadan hemen önce %18'lik çözelti hazırlayın
Boya fırçası	Balıkçı Bilimsel	11860
50 mL santrifüj tüpleri	Denville	C1062-P
Kepçe	Balıkçı Bilimsel	14-357Ç
500 mL yuvarlak geniş ağızlı şişe	Borcam	1395-500
Hücre süzgeci (300 mm gözenek)	Çoğul Seçimi	43-50300	Larva yıkama için isteğe bağlı ürün
Karton kutu (flakon tepsisi)	Genesee Bilimsel	FS32-124

arası adet arası Serisi