Bu protokol, Chiu ve ark., Drosophila'da Sirkadiyen Ritimleri ve Uyku Parametrelerini İncelemek için Lokomotor Aktiviteyi Test Etme, J. Vis. Uzm.(2010).
1. Sineklerin Aktivite Tüplerine ve Lokomotor Aktivite İzleme Sistemine Yüklenmesi
- Sinekleri aktivite tüplerine yüklemeden önce, aktivite monitörlerini barındırmak için kullanılacak inkübatörleri açın. İnkübatör kontrollerini kullanarak sıcaklığı ayarlayın ve istenen deneysel tasarıma göre DAM Sistemi ışık kontrol cihazını VEYA inkübatörlerin kendi ışık kontrol sistemini kullanarak aydınlık/karanlık rejimini ayarlayın. Sinekleri aktivite tüplerine yüklemek için gereken süre, sıcaklığın stabilize olması için yeterli olmalıdır.
- Sinekleri karbondioksit ile uyuşturun.
- Tek bir sineği nazikçe bir aktivite tüpüne aktarmak için ince bir boya fırçası kullanın.
- İnce forseps ile yaklaşık yarım inç olan tek bir iplik parçasının ortasını tutun ve açıklığı tıkamak ve deney sırasında sineğin kaçmasını önlemek için ipliği aktivite tüpünün gıda olmayan ucuna yerleştirin, aynı zamanda tüpe hava akışına izin verin. Alternatif olarak, açıklığı kapatmak için küçük delikli plastik kapaklar (Trikinetics, Inc.) kullanılabilir.
- Sinek uyanana kadar tüplerin yan yatırıldığından emin olun, aksi takdirde sineğin yiyeceğe yapışma riski vardır.
- Tüpleri aktivite monitörlerine yerleştirin. Trikinetik monitörlerin daha yeni, daha kompakt modelinde (Trikinetik DAM2 ve DAM2-7), kızılötesi ışının tüpü merkez konumda geçmesini sağlamak için tüpleri lastik bantlarla yerinde tutmak gerekir.
- Aktivite monitörlerini inkübatörlere yerleştirin ve telefon kabloları aracılığıyla veri toplama sistemine bağlayın. Tüm monitörlerin doğru şekilde bağlandığından ve her birinden veri toplandığından emin olmak için DAM Sistemi toplama yazılımını kullanarak kontrol edin. Monitör, her bir cam aktivite tüpünün merkezi boyunca kızılötesi ışık huzmesi yayar. Sineklerin lokomotor aktivitesi, kızılötesi ışının her kırılışında "bir" kaydedildiği veya kızılötesi ışının kırılmadığı bir "sıfır" kaydedildiği ham ikili veri olarak kaydedilir.
2. Sirkadiyen Periyodiklik ve Genliğin Belirlenmesi için Verileri Kaydetmek için Deneysel Tasarım
- Sinekler 2-5 tam gün boyunca istenen aydınlık/karanlık (LD) ve sıcaklık rejimine maruz bırakılarak senkronize edilir ve sürüklenir. En yaygın olarak kullanılan sürüklenme koşulu, 25 ° C'de 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık (12:12 LD) aydınlık / karanlık döngüsüdür. Genel olarak kabul edilen bu standart koşul, esasen Drosophila'nın Afro-ekvatoral bölgelerden kaynaklandığı düşüncesine dayanmaktadır. Sirkadiyen ritimleri incelerken, aşina olunması gereken bazı ifadeler vardır. Bu protokolle ilgili olarak, inkübatörde ışıkların yandığı zaman, zeitgeber zamanı 0 (ZT0) olarak tanımlanır ve diğer tüm zamanlar bu değere göredir (örneğin, 12:12 LD döngüsünde, ZT12 ışıkların kapatıldığı zamandır). Standart 12:12 LD koşulları altında, yabani tip Drosophila melanogaster tipik olarak iki aktivite nöbeti sergiler; biri "sabah" zirvesi olarak adlandırılan ZT0 ve diğeri "akşam" zirvesi olarak adlandırılan ZT12 etrafında merkezlenmiştir (Şekil 1A). Sabah ve akşam nöbetleri endojen saat tarafından kontrol edilir, ancak aydınlık / karanlık geçişlerine yanıt olarak geçici aktivite patlamaları olan "irkilme" tepkileri de vardır. İki günlük sürüklenme minimumdur ve örneğin, daha fazla zaman alan ve sürekli karanlıkta serbest çalışma dönemlerini ölçmeye yönelik büyük ekranlarda kullanılabilir (aşağıya bakın, adım 2). Bununla birlikte, günlük bir aydınlık-karanlık döngüsü sırasında aktivite modellerini incelemekle ilgileniyorsanız, daha fazla veri elde etmek için sinekleri LD'de 4-5 gün boyunca tutmak tercih edilir. Esasen, nihai veri analizinde sinek sayısının veya LD günlerinin sayısının arttırılması (örneğin, son iki günlük LD lokomotor aktivitesinden elde edilen havuz verileri) daha güvenilir günlük aktivite profilleri ve ölçümleri (örneğin, sabah veya akşam zirvesinin zamanlaması) üretecektir. Ayrıca, günlük aktivite dağılımı, gün uzunluğu (fotoperiyot) ve sıcaklığın bir fonksiyonu olarak değişir. Fotoperiyodu veya sıcaklığı standarttan değiştirmenin önemli bir nedeni, günlük aktivite modellerinin mevsimsel adaptasyona nasıl uğradığını incelemek istemesidir (örneğin, Chen ve diğerleri, Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). Drosophila ayrıca günlük sıcaklık döngülerine de sürüklenebilir (örneğin, Glaser ve Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova ve diğerleri, Neuron (2009)). Sadece 2-3 °C arasında değişen sıcaklık döngüleri, aktivite ritimlerini sürüklemek için yeterlidir.
- Serbest çalışan lokomotor aktivite ritimleri, sürüklenme periyodu bittikten sonra sabit karanlık ve sıcaklık koşulları altında ölçülür (yukarıya bakın, adım 1). Işık döngüsünün ayarı, LD'nin son gününde karanlık fazda herhangi bir zamanda değiştirilebilir, böylece deneyin sonraki günü DD'nin ilk gününü temsil eder. Yedi günlük DD veri toplama, sineklerin sirkadiyen periyodunu ve genliğini (örneğin, ritmin gücü veya gücü) hesaplamak için yeterlidir. Genel olarak, belirli bir genotip için güvenilir serbest dolaşım periyotları elde etmek için en az 16 sinekten oluşan bir örneklem büyüklüğü gereklidir. Kişi sadece günlük aktiviteyi ölçmekle ilgilense bile, endojen dönemdeki değişiklikler LD'deki günlük aktivite dağılımını değiştirebileceğinden, sineklerin DD'deki serbest çalışma periyotlarını ölçmek en iyisidir. Örneğin, uzun endojen dönemlere sahip sinekler genellikle LD'de gecikmiş akşam zirveleri sergiler (örneğin, bkz. Şekil 2).
- Deneyin sonunda, DAM System yazılımı kullanılarak toplanan ham ikili veriler, taşınabilir bir veri depolama cihazına, örneğin USB anahtarına indirilir.
- Ham ikili veriler DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) kullanılarak işlenir ve sirkadiyen parametreleri analiz ederken 15 ve 30 dakikalık bölmelere veya uyku/dinlenme parametreleri analiz edilirken 1 ila 5 dakikalık bölmelere toplanır. Şu anda, Drosophila'da beş bitişik dakika hareketsizlik, uyku/dinlenmenin standart tanımıdır (Hendricks ve diğerleri, Neuron (2000); Ho ve Sehgal, Yöntemler Enzimol., (2005)).
- DAM Sisteminde toplanan verileri analiz etmenin birçok farklı yolu vardır, ancak yalnızca laboratuvarımızda rutin olarak kullanılan yöntemleri sağlayacağız. Microsoft Excel, farklı örnek gruplarına genotip atamak için kullanılır. FaasX yazılımı (M. Boudinot ve F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Fransa) veya Insomniac (Matlab tabanlı program; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) sırasıyla sirkadiyen (örneğin dönem ve güç) veya uyku/dinlenme (örneğin uyku yüzdesi, ortalama dinlenme süresi uzunluğu) parametrelerini incelemek için kullanılır.
