$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, de Vries ve Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).
1. Channelrhodopsin Sinekleri Oluştur
- Çapraz UAS-ChR2, seçtiğiniz Gal4 sürücüsü ile uçar, optik lobdaki Foma-105 nöronlarında ifade edilen G4-Gal1'ü kullanırız.
- Mavi ışık uyarımına görsel bir yanıt olasılığını ortadan kaldırmak için, her iki sinek hattı da w+norpA arka plandadır.
- Sonuç: w+norpA; G105-Gal4/UAS-CHR2 +
- Yetişkin sinekler yaklaştıktan sonra, seçilen dişileri, davranışsal testi gerçekleştirmeden önce 3 gün boyunca 10 μM all-trans-retinal (ChR2 için gerekli bir kofaktör) ile desteklenmiş ve ışıktan korunan taze yiyeceklere koyun.
2. 10 μM All-trans-retinal Geliştirilmiş Gıda Yapın
- 20 mM retinal yapmak için 100 mg all-trans-retinal'i 17.6 ml% 95 etanol içinde çözün. Tüm trans-retinalleri her zaman ışıktan koruyun.
- Standart mısır unu sinek yemini mikrodalgada eritin ve dokunulamayacak kadar ısınana kadar soğumaya bırakın.
- 50 μl 20 mM all-trans-retinal'i 10 ml sinek yemi şişelerine karıştırın.
- Şişeleri soğumaya bırakın ve ışıktan koruyun.
3. Ekipman
- Pipet uçları: Standart 1.000 μl pipet uçları uca yakın kesilerek ~2,25 mm'lik bir gözenek çapı oluşturulur.
- Platform (bkz. Şekil 1).
- 17 cm X 25 cm boyutlarında bir Delrin tabanı, 1/4" NPT soğutma suyu hortumu bağlantılarına uyacak şekilde her köşede dişli deliklerle inşa edilmiştir.
- Tabanın merkezine Delrin'den yapılmış dikey bir tutucu takılmıştır. Genel boyutlar 25 mm X 40 mm X 65 mm'dir (genişlik X derinlik X yükseklik). 10 mm genişliğinde bir oluk, altta bir kelebek vida ile tutucunun uzunluğu boyunca uzanır. Tutucunun üst kısmına, 25 mm X 40 mm X 10 mm boyutlarında, tutucudaki oluk ile hizalanmış 3,5 mm çapında bir delik bulunan bir platform takılmıştır.
- LED dizileri (bkz. Şekil 1).
- ~18 cm uzunluğundaki dört soğutma sıvısı hortumu kolu, soğutma sıvısı hortumu bağlantısı kullanılarak platform tabanına tutturulur. Soğutma sıvısı hortumu sadece yapısal destek olarak kullanılır ve soğutma amaçlı kullanılmaz.
- Uygun şekilde yerleştirilmiş oluklar, her bir kolun ucuna bir ısı emici takmak için her bir kolun son soğutma sıvısı hortumu parçasına kesilir.
- Mavi bir LED Rebel Tri-Stars, önceden kesilmiş termal yapışkan bant kullanılarak her bir soğutucuya monte edilmiştir. Her bir Tri-Star'a bir Carclo 18° Tri-lens yapıştırılmıştır.
- LED Tri-Stars, BuckPuck DC sürücülerine ve belirtildiği gibi bir güç kaynağına bağlanır. Kurulumumuzu, her bir BuckPuck'ın seri olarak iki Tri-Star'a güç verecek şekilde düzenledik.
- Dört LED Tri-Star'ın tümünün 700 mA'da aydınlatılması, platformumuzda 713 W/m2'lik bir ışınım sağladı.
- Kamera: Kamera küçük bir tripod üzerine monte edilmiştir ve platformun üst kısmına odaklanmıştır.
4. Davranışsal Test
- Buz üzerindeki sinekleri kısaca uyuşturun.
- Ucun her iki ucunu kapatmak için bant kullanarak tek tek sinekleri pipet uçlarına yerleştirin.
- Sinekler uyandıktan ve pipet ucunu aktif olarak keşfettikten sonra, bandı çıkarın ve dikey tutucudaki oluğa bir pipet yerleştirin. Kelebek vida, pipet ucunu yerine sabitlemek ve ucun altını kapatmak için kullanılır.
- Sinek pipet ucunu keşfederken (tipik olarak 30 - 60 saniye), sinek uçtan platforma çıkmadan hemen önce kamera kaydını başlatın.
- Sinek platforma çıktıktan sonra 1-2 saniye bekleyin ve mavi LED'leri açın. Sineğin uçuşu başlatmasına kadar geçen süreyi manuel olarak ölçmek için bir zamanlayıcı kullanın.
