Bu protokol, Vogler ve Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009) kitabından bir alıntıdır.
1. Başlamadan önce
- 108mM Na+, 5mM K+, 2mM Ca2+, 8mM MgCl2, 1mM NaH2PO4, 4mM NaHCO3, 10mM sükroz, 5mM trehaloz, 5mM HEPES (pH 7.1, Sigma Chemicals'ın tüm reaktifleri) içeren taze hazırlanmış yapay hemolenf (AH) çözeltisi. Sükroz ve trehaloz, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için kullanımdan hemen önce soğutulmuş stok çözeltilerinden AH'ye eklenmelidir.
- AH'yi oda sıcaklığına getirin ve çözeltiyi en az 15 dakika hava köpürterek oksijenlendirin.
- Yağın alınması için gerekli olan birkaç ince kılcal damarı (örneğin Cam Kılcallar, 100ul, VWR) çekin.
2. Yetişkin Sinekten Yarı Sağlam Drosophila Kalbi
- Erişkin Drosophila sinekleri Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) ile 2-5 dakika süreyle uyuşturulur. Daha uzun pozlamalar için sinekleri Fly Nap'ta bırakmamaya özen gösterilmelidir. Soğuğa kısa süreli maruz kalma sinekleri uyuşturmak için de kullanılabilir, ancak CO2 kalp atış hızı ve ritmiklik üzerinde daha uzun süreli etkileri olduğu için önerilmez.
- Uyuşturulmuş sinekler, sırt tarafı aşağı bakacak şekilde, ince bir vazelin tabakası ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirilir. Kanatlardaki ve vücuttaki hidrofobik kütikül, jöleye geri dönüşümlü olarak "yapışır", ancak gerekirse sinek yeniden konumlandırılabilir. Bu, sonraki manipülasyonlar sırasında özellikle önemli hale gelir.
- İlk kesim, kavisli bir çift yaylı makas (Roboz #5611) kullanılarak yapılır. Makas bıçakları bacakların altına yerleştirilir ve boynun yakınındaki göğüs kafesinin sırt yüzeyine doğru aşağı doğru açılı olarak yerleştirilir. Baş, ventral sinir kordonu ve bacaklar tek bir kesi ile çıkarılır. Preparat daha sonra oksijenli, yapay hemolenf (AH) çözeltisine daldırılır.
- Yaylı makas kullanılarak karnın arka ucu (karın segmentleri 7 ve 8'den oluşur) tek bir kesi ile çıkarılır. Bu, karnın her iki kenarı boyunca yanal kesimler yapmak için erişim sağlar ve arka bağırsak ile abdominal kütikül arasındaki bağlantıyı kesmeye hizmet eder. Serbest kalan ventral abdominal kütikül flebi daha sonra çıkarılır.
- 3. ve 4. adımlarda, bağırsağın ön ve arka bağlantıları kesilir, böylece karın organları artık sadece trakeoller tarafından yerinde tutulur. Bağırsak ve diğer karın organları genellikle kuyumcu forsepsleri (Roboz, #55) ve hafif çekme kullanılarak tek bir kitle olarak çıkarılabilir. İç organların çıkarılması, yağ cisimleriyle çevrili dorsal kütiküle hala bağlı olan atan kalp tüpünü ortaya çıkarır.
- Yağ kütleleri ışık mikroskobunda oldukça opaktır, bu nedenle kalp tüpünü net bir şekilde görebilmek için genellikle bu yağın bir kısmını çıkarmak gerekir. Bu, ince çekilmiş cam kılcal damarlar kullanılarak yapılan bir liposuction tekniği ile gerçekleştirilir. Kılcal damarlar, standart bir pipet çektirmesi (örneğin Sutter P-97 Pipet Çektirmesi) kullanılarak yapılır ve daha sonra bir vakum kaynağına bağlı plastik boruya (Tygon, 1/16") yerleştirilir. Bu sistem, kalp tüpünün etrafındaki fazla yağı emmek için kullanılır. Emiş kuvveti uç çapı ile orantılıdır, bu nedenle çapı 40 mikrondan büyük olan pipetler kullanılmamalıdır. Kalbin kendisine dokunmaktan kaçınmak için çok dikkatli olunmalıdır ve kalbin arka kısmı çok kırılgan olduğu için bu bölgeden tamamen kaçınılmalıdır.
- Yetişkin Drosophila kalp tüpü artık açıkta ve atıyor olmalı. Gerekirse, kütikül ve bağlı kalp, kütikülü vazelinden nazikçe kaldırarak ve tekrar kalp dokusuyla herhangi bir temastan kaçınarak dikkatlice geri sıkıştırarak yeniden konumlandırılabilir. Bu noktada, preparatın yıkandığı çözelti taze AHL ile değiştirilmelidir. Bu preparatın, herhangi bir manipülasyondan önce oksijenasyon ile 20-30 dakika dengelenmesine izin verilmelidir. Preparat 60 dakikadan daha uzun süre sürdürülecekse, taze AHL ile perfüze edilmelidir.
