$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Gou ve ark., Bireysel Drosophila melanogaster'in Yumurtlama Tercihlerini İncelemek için Yüksek Verimli Test, J. Vis. Exp. (2016).
1. Oda Yapımı, Montaj, Tahlil Kurulumu
- Bir makine atölyesine akrilik yumurtlama odaları yaptırın (Şekil 1A-D). Farklı parçaların mühendislik çizimleri Ek Şekil 1-3'te gösterilmiştir. Yüksek çözünürlüklü resimler de burada bulunabilir (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Plastik levhaları, Şekil 1'de gösterildiği gibi haznenin yükleme (üst) parçasına yerleştirin. Bu, sinekleri bireysel yumurtlama alanlarına yüklerken alt yüzey görevi görür.
- Dişileri bir CO2 pedi üzerinde uyuşturun ve her bir yumurtlama alanına ayrı ayrı yükleyin. Sineklerin CO2'den iyileşmesi ve yeni ortama alışması için ~ 30 dakika bekleyin.
- Agaroz substratlarını hazırlayın.
- Kolaylık sağlamak için, 55 °C'lik bir su banyosunda önceden hazırlanmış bir şişe eritilmiş %1 agaroz bulundurun.
- İstenilen miktarda stok sükroz çözeltisini (2 M) 50 ml'lik konik bir tüpe ekleyin ve uygun miktarda agaroz ile karıştırın. Örneğin, 150 mM sükroz substratını hazırlamak için, 750 μl 2 M sükroz çözeltisini tüpe yerleştirin ve ardından tüpü 10 ml işaretine kadar agaroz ile doldurun.
- Düz alt tabakayı da aynı şekilde hazırlayın, ancak sakaroz çözeltisi yerine damıtılmış su ekleyin.
NOT: Bu protokoldeki nihai agaroz konsantrasyonu% 1'den biraz daha azdır. Deneyimlerimize göre, agarozun tam konsantrasyonu, ~% 0.9 - 1.1 arasında olduğu ve iki substratın aynı agaroz konsantrasyonuna sahip olduğu kontrol edildiği sürece önemli değildir.
- Haznenin alt tabaka (alt) parçasını alın ve Şekil 1'de görüldüğü gibi her oluğa 1.000 μl agaroz substratı pipetleyin.
- Agarozun ~ 30 dakika katılaşmasına izin verin.
- Agaroz substratları ve sinekler hazır olduğunda, yumurtlama odasının üç parçasını da birleştirin ve ardından plastik tabakaları çıkarın.
- Odaları sinek kuluçka makinelerine yerleştirin.
NOT: Yumurtlama deneylerinin uzunluğu, deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak değişebilir. Genellikle deneyi O/N (14 - 16 saat) çalıştırırız. Ayrıca, sirkadiyen zamanlamanın yumurtlama tercihleri üzerinde önemli bir etkisi gözlenmemiştir.
- Odaya CO2 enjekte ederek kadınları uyuşturun. Hazneyi sökün, uyuşturulmuş sinekleri sinek morguna atın (yani, biraz mısır yağı ile doldurulmuş boş bir kahve kutusu). Kayıt tutmak için sonuçların resimlerini çekin (bkz. Şekil 2).
- Yumurta sayısını manuel olarak sayın ve analiz için tercih indekslerini hesaplayın. Tercih indeksini şu şekilde hesaplayın: (Na - Nb)/(Na + Nb) burada Na ve Nb, sırasıyla a ve b bölgesindeki yumurta sayısını temsil eder.
