C. elegans Blastomer Diseksiyonu: Yumurta Kabuğunu Çıkarmak ve Embriyonik Hücreleri Ayırmak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Hsu, C. R., et al. İzole Caenorhabditis elegans Embriyo Blastomerleri ve Yapışkan Polistiren Boncuklar ile Uzamsal Hücre Temas Modellerinin İn Vitro Sulandırılması.J. Vis. Uzm.(2019).

Bu video, erken embriyolardan C. elegans blastomerlerini izole etmek için bir yöntem sunar. Elde edilen hücreler, hücre kültürü veya ex vivo deneyler için uygundur.

Protokol

Bu protokol, Hsu ve ark., İzole Caenorhabditis elegans Embriyo Blastomerleri ve Yapışkan Polistiren Boncuklar ile Uzamsal Hücre Temas Modellerinin İn Vitro Sulandırılması, J. Vis. Exp.(2019).

1. Embriyo blastomer izolasyonu
2. Ağartma solüsyonunun kesilmesini ve temasını önlemek için eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.
   1. Bir mikrokılcal damarın her iki ucunu (kapasite; 10 μL) sağ ve sol elinizle tutun.
   2. Gerilim uygulamak için mikrokılcal damarı her iki uca doğru çekin ve elle çekilmiş iki kılcal damar yapmak için kılcal damarın merkezini bir brülörün üzerine getirin (Şekil 1A).
   3. Elle çekilen kılcal damarların uçlarını diseksiyon mikroskobu altında forseps ile kesin ve çekilen kılcal damarı bir ağız pipetleme aparatına takın. İki tür pipet hazırlayın. Pipetler için uç açma boyutları, embriyo transferi ve yumurta kabuğunun çıkarılması için sırasıyla C. elegans embriyolarının kısa eksen uzunluğunun yaklaşık 2 katı ve 1 katı (30 μm) olmalıdır, Şekil 1B-D).
   4. 45 μL yumurta tuzu çözeltisini çok kuyulu bir lam kuyusuna pipetleyin (Şekil 2A; alt).
   5. 5-10 yetişkin C. elegans'ı yumurta tuzu çözeltisi içeren bir kuyuya koyun.
   6. Erken C. elegans embriyolarını elde etmek için, C. elegans gövdesinin sağına ve soluna iki iğne yerleştirerek ve iğneleri birbirinin yanından kaydırarak yetişkinleri parçalara ayırın (Şekil 2A; üst şemalar).
   7. 45 μL hipoklorit çözeltisini, yumurta tuzu çözeltisi içeren kuyunun yanındaki bir kuyuya pipetleyin (Şekil 2B).
   8. Shelton'un büyüme ortamının 45 μL'sini, hipoklorit çözeltisi içeren kuyunun yanındaki sonraki üç kuyucuğa pipetleyin (Şekil 2B).
   9. 1 hücreli evre ve erken 2 hücreli evre embriyoları, embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damar ile ağızdan pipetleme yaparak hipoklorit çözeltisine aktarın (Şekil 2B).
   10. 40-55 saniye bekleyin.
   11. Embriyoları hipoklorit çözeltisinden Shelton'ın büyüme ortamına aktararak, embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damar ile ağız pipetlemesi yaparak embriyoları yıkayın (Şekil 2B).
   12. Embriyoları, embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damar ile ağızdan pipetleme yaparak Shelton'ın büyüme ortamının yeni bir kuyusuna aktararak embriyoları tekrar yıkayın (Şekil 2B).
   13. Yıkanmış embriyoları, embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damar ile ağızdan pipetleme yaparak Shelton'ın büyüme ortamının yeni bir kuyusuna aktarın. Yumurta kabuğunu çıkarmak için elle çizilmiş kılcal damarı kullanarak pipetleme işlemini dikkatlice tekrarlayın (Şekil 2C; ortadaki şemalar). Yumurta kabuğu başarılı bir şekilde çıkarılırsa, embriyonik hücreler daha küresel hale gelecektir (Şekil 2C; sağda).
   14. Yumurta kabuğunu çıkarmak için elle çizilmiş kılcal damar ile nazikçe ve sürekli pipetleyerek 2 hücreli aşama embriyonik blastomerleri ayırın (Şekil 2D).

Şekil 1: Blastomer izolasyonu.(A) Cam kılcal damarın elle çekilmesi. (B) Embriyo transferi için elle çizilmiş cam kılcal damar. (C) Yumurta kabuğunun çıkarılması için elle çizilmiş cam kılcal damar. (D) Yumurta kabuğunun çıkarılması için uygun kılcal açıklık boyutunu gösteren şemalar. Oklar embriyoları gösterir. Ölçek çubukları 100 μm'yi gösterir.

Şekil 2: Blastomer izolasyon iş akışı.(A) Embriyo elde etmek için yetişkin C. elegans'ın yumurta tuzu tamponunda diseksiyonu. Fotoğraflar, yumurta kabuğu çıkarılmadan önce 2 hücreli ve 4 hücreli aşama embriyolarını göstermektedir. (B) Hipoklorit tedavisi ve yıkama. (C) Şemalar, yumurta kabuğunun çıkarılması için uygun zamanlamayı göstermektedir. Fotoğraf, yumurta kabuğunun çıkarılmasından sonra 4 hücreli bir aşama embriyosunu göstermektedir. (D) Blastomer ayrımı. Fotoğraf, ayrılmış 2 hücreli bir aşama embriyosunu göstermektedir. C ve D'deki okların boyutları, pipetleme sırasında gereken bağıl kuvvetleri gösterir. Ölçek çubukları 50 μm'yi gösterir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aspiratör Borusu Komplesi	Drummond	21-180-13	Blastomer izolasyonu için.
Caenorhabditis elegans suşu: N2, vahşi tip	Caenorhabditis Genetik Merkezi	N2	Bu çalışmada kullanılan suş
Caenorhabditis elegans suşu: KSG5, genotip: zuIs45; itIs37	Evde	KSG5	Bu çalışmada kullanılan suş
Kalibre Edilmiş Mirkopipetler, 10 μL	Drummond	21-180-13	Blastomer izolasyonu için
CD Lipid Konsantresi	Yaşam Teknolojileri	11905031	Blastomer izolasyonu için. Doku kültürü davlumbazında çalışın.
Clorox	Clorox Gölü	N. A.	Blastomer izolasyonu için. Hipoklorit tedavisi iyi çalışmadığında yeni bir şişe açın.
Lamel tutucu	Evde	N.A.	Blastomer izolasyonu için.
Diseksiyon mikroskobu: M standlı Zeiss Stemi 508. Işık kaynağı dahili LED'dir. Göz merceğinin büyütme oranı 10X'tir.	Carl Zeiss	Stemi 508	Blastomer izolasyonu için.
Fetal Sığır Serumu, Nitelikli Tek Atış, Kanada menşeili	Gibco (Gibco)	A3160701	Blastomer izolasyonu için. Doku kültürü davlumbazında çalışın.
Genel Kullanım ve Hassas Kayma Hipodermik İğneler, 25 gauge	Bd	14-826AA	Blastomer izolasyonu için
İnülin	Alfa Aesar	AAA1842509	Blastomer izolasyonu için
MEM Vitamin Çözeltisi (100x)	Gibco (Gibco)	11120052	Blastomer izolasyonu için.
Multitest Slayt 10 Kuyusu	MP Biyomedikal	ICN6041805	Blastomer izolasyonu için
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)	Gibco (Gibco)	15140148	Blastomer izolasyonu için.
Polivinilpirolidon	Fisher BiyoReaktifleri	BP431-100	Blastomer izolasyonu için
Potasyum Klorür	Biyodükkan	POC888	Blastomer izolasyonu için
Schneider'in Drosophila Steril Ortamı	Gibco (Gibco)	21720024	Blastomer izolasyonu için. Doku kültürü davlumbazında çalışın.
Sodyum Klorür	Biyodükkan	SOD001	Blastomer izolasyonu için
sodyum hidroksit çözeltisi, 10 N	Fisher Kimya	SS255-1	Blastomer izolasyonu için
Şırınga Filtreleri, PTFE, Steril Olmayan	Basix	13100115	Blastomer izolasyonu için.
Tygon S3 Laboratuvar Hortumu, Formülasyon E-3603, İç çap 3.175 mm	Saint Gobain Performans Plastikleri	89403-862	Blastomer izolasyonu için.
Tygon S3 Laboratuvar Hortumu, Formülasyon E-3603, İç çap 6,35 mm	Saint Gobain Performans Plastikleri	89403-854	Blastomer izolasyonu için.

Serisi · Serisi Serisi Serisi Serisi Belediyesi