C. elegans Kemotaksis Testi: Solucanlarda Kemosensasyonu Test Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Campbell, J. C., et al. A Caenorhabditis elegans Beslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Testi. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, nematod C. elegans'ta kemotaksisi tanıtıyor ve bakır sülfata karşı kemotaktik kaçınmayı test eden örnek bir protokolü gösteriyor.

Protokol

Aşağıdaki protokol Campbell ve ark., A Caenorhabditis elegans Beslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Testi, J. Vis. Exp. (2017).

1. Deney Organizmalarının Hazırlanması
   1. Test edildiğinde organizmaların genç yetişkinler olduğundan emin olmak için teste başlamadan 24 saat önce suş başına 10 L4 aşamalı nematod seçin. Test edilen her mutant veya kontrol nematodu için 10 L4 seçin (kontrol için 10 ve test için 10).
      1. OP50 Escherichia coli ile tohumlanmış standart agar plakalarında 24 saat boyunca standart yöntemler kullanarak L4 organizmalarını koruyun. Sonraki yıkama adımları sırasında organizmalar kaybolursa, başlangıç numune boyutunu artırarak telafi edin (yani, 10 yerine 20 solucan toplayın).
         NOT: Davranış, doğuştan değişken bir fenotiptir. Yöntemi, her suş için üç ayrı günde üç kopya halinde gerçekleştirin. Tartışma bölümünde vurgulandığı gibi, yeni suşlar için ek kontrol suşları ve koşulları ekleyin.
   2. Tahlilden hemen önce, deney organizmalarını bakteri içermeyen bir agar plakasına aktarın ve fazla bakterileri uzaklaştırmak için nematodların 1 dakika boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin.
      1. Deneysel organizmalar, testten önceki 24 saat boyunca kontaminasyon koşullarına maruz kaldıysa, bunları atın.
   3. Solucanları bir mikrosantrifüj tüpüne yıkamak için bakteri içermeyen plakaya 1 mL M9 pipetleyin.
   4. 1 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin. Solucanlar tüpün dibinde bir pelet oluşturmalıdır. Solucan peletini bozmadan M9 solüsyonunu aspire edin. Solucan peletine 1 mL M9 ekleyin, solucanları çözelti ile karıştırmak için tüpü ters çevirin.
   5. Adım 1.4'ü üç kez daha tekrarlayın.
      1. Fazla bakteri başlangıçta solucanlarla birlikte aktarıldıysa, toplam 5 kez tekrarlayın. Bakır gıda yarış plakalarına hiçbir bakteri aktarılmamalıdır. Yiyecekler tahlil plakasına aktarılırsa, doğru veri toplamayı engelleyecektir.
   6. Son yıkamadan sonra, süpernatanı 100 μL M9 olana kadar aspire edin ve solucan peleti kalır.
      Dikkat: Açlıkla ilgili davranışlar 30 dakika sonra belirginleşir. Sonuç olarak, yıkama adımları tamamlandıktan sonra solucanlar derhal çözeltiden aktarılmalıdır.
2. Tahlil Plakalarının Hazırlanması
   1. Tahlilden iki gün önce standart NGM agar plakalarını hazırlayın.
      1. Plakalar nemli bir ortamda tutulursa, testten 3 gün önce agar plakaları yapın. Alternatif olarak, uygun kuruluğu sağlamak için (steril bir ortamdaysa) plakanın kapağını 3 - 6 saat çıkarın.
   2. Kalın bir kalıcı işaretleyici ile, plakanın alt tarafında dış kenar boyunca bir çizgi ve bir orta çizgi bariyeri oluşturmak için başka bir çizgi yapın (Şekil 1). Orta hat bariyeri, plakanın her bir kenarından eşit uzaklıkta olmalıdır. Hassas ölçümler sağlamak için bir cetvel kullanın. Bu çizgiler, bakterileri ve bakır çözeltisini aktarırken bir kılavuz görevi görecektir. E. coli'nin bakır çözeltisinden önce aktarılması şartıyla, bu çizgiler gösterge görevi görecektir.
   3. Düzgün bir çim oluşturmak için bakır bariyerin sadece bir tarafında 50 μL OP50 E. coli içeren tohum plakası (Şekil 2). Bakteri konsantrasyonu tahliller arasında tutarlı kalmalıdır; Bununla birlikte, konsantrasyondaki hafif farklılıklara yanıt olarak çok az değişkenlik gözlenmiştir.
      1. Bakterilerin bakır çözeltisiyle temas etmemesini sağlamak için plakanın alt tarafındaki işaretli çizgileri kullanın. Bakır çözeltinin plakanın kenarını kaplaması ve bir orta hat bariyeri oluşturması şartıyla, bakterileri, bakır çözeltisi besin kaynağı ile temas etmeyecek şekilde aktarın.
   4. İkinci bir plaka setini işaretleyin ve bunlara OP50 E. coli aktarmayın (Şekil 2). Bu plakalar negatif kontrolü değerlendirmeye hizmet edecektir. Bu plakalar ayrıca, ilk transfer kaynağını belirtmek için plakanın bir yarısında bir işarete sahip olmalıdır.
   5. Bakterilerin kurumasını bekleyin, ardından plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. 37 °C'lik bir inkübatöre veya odaya aktarırken bakteri lekelerinin bozulmadığından emin olun. Aşırı rahatsızlık, yiyecek yamasının yerini veya şeklini değiştirebilir.
3. Kemotaksis Testi
   1. Tahlil başlangıç zamanından önce 0,5 M bakır (II) sülfat çözeltisini taze olarak hazırlayın. Plaka başına 125 μL çözelti kullanılması şartıyla, kullanılan tahlil plakalarının sayısına bağlı olarak bu hacmi artırın (ör. 5 tahlil plakası, 625 μL).
   2. Bir dış bakır bariyer oluşturmak için agarın kenarına 100 μL bakır (II) sülfat çözeltisi pipetleyin. Plakanın işaretli alt tarafı bir kılavuz görevi görmelidir.
   3. Bir orta hat bariyeri oluşturmak için 25 μL bakır (II) sülfat solüsyonunu pipetleyin.
      1. Bakır (II) sülfat çözeltisinin bakteri yaması ile temas etmediğinden emin olun. Agar üzerindeki girintiler/çizikler nedeniyle çizgilenme hareketi etkileyebileceğinden benekli bir teknik kullanın.
   4. Bakır çözeltinin plaka üzerinde kurumasını bekleyin. Süre, plaka ve laboratuvar koşullarına bağlı olarak değişebilir. Transferden sonra her 5 dakikada bir kuruluğu görsel olarak kontrol edin.
      NOT: Bakır çözeltisi mavimsi bir renk tonu gösterir ve kolayca tanımlanabilir. Kuruluğu ayırt etmek için çözeltiyi plakanın kenarına yakın bir yere hafifçe vurmak için bir laboratuvar dokusu kullanın.
   5. Tüpün altından 20 μL solucan peletini tahlil plakasının bakteri içermeyen yarısına pipetleyin.
      1. 10 solucanın tahlil plakasına aktarıldığından emin olun. Yanlışlıkla fazladan solucanlar dahil edilmişse, plakaya bakteri eklenmediğinden emin olmak için halokarbon yağı ile toplayarak bunları çıkarın. Her tahlil, tahlil sırasında tutarlı sayıda nematoda sahip olmalıdır.
         NOT: Tahliller sırasında çok az sayıda solucan aktarılırsa, ilk numune boyutunun arttırılması, yıkama ve transferler sırasında potansiyel kayıpları azaltacaktır.
   6. Fazla M9'u bir laboratuvar dokusu ile plakadan çıkarın. M9, bakır (II) sülfat çözeltisi ile temas etmemelidir.
      Dikkat: Bu adımı gerçekleştirirken solucanların ve agar yüzeyinin etkilenmediğinden emin olun. Çok sert kullanılırsa, laboratuvar dokusu plakanın agar yüzeyinde girintiler oluşturabilir ve solucanları çıkarabilir. KimWipe aracılığıyla yanlışlıkla kaldırılan solucanlar atılmalıdır.
   7. M9 çözeltisi çıkarıldıktan ve tüm solucanlar sıvı olmayan lokomotor modellerine başladıktan sonra, tahlil kronometresini başlatın.
      1. Optimal olarak, M9 çözeltisini bir dakika içinde çıkarın. Temel parametre, sinüzoidal hareketin tanımlanmasıdır. Solucanlar farklı şekilde hareket eder, örneğin sıvı içindeyken sinüzoidal yerine dövülür. Deney organizmalarının her biri atmayı bıraktığında tahlil durdurma saatini başlatın.
   8. Her 30 dakikada bir tahlil plakalarını kontrol edin.
      1. Bakteriyel yamaları olan tahlil plakaları için, 4 saatlik bir süre içinde gıda yamasına ulaşırlarsa organizmaları pozitif olarak puanlayın. Negatif kontrol plakaları için, bariyeri geçtiklerinde organizmaları pozitif olarak puanlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: 5 cm'lik Bir Petri Kabının Alt Tarafına Bakır Çözeltisi Yerleştirildiğini Gösteren İşaretlerin Görsel Temsili. Bu endikasyonlar, plakanın bölümlerinin uygun şekilde ölçülmesini sağlamak için kullanılır ve bakteri yamasını ve ardından bakır çözeltisini agar yüzeyine aktarırken bir kılavuz görevi görür.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
M9 Çözeltisi [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O ila 1 litre. Kullanmadan önce sterilize etmek için otoklav.]			Laboratuvarda üretilmiştir
Bakır Sülfat	Sigma	C-1297	0,5 M'lik bir konsantrasyona uygun şekilde askıya almak için su kullanın

Serisi