$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol Teoh ve ark., Caenorhabditis elegans'ta Hücresel Yapıları ve Organel Morfolojisini İncelemek İçin Kantitatif Yaklaşımlar, J. Vis. Exp. (2019).
>1. Vücut duvarı kas yapısının ölçülmesi
- Vücut duvarı kas yapısının floresan görüntülemesi
- Miyozin liflerini GFP.
ile etiketleyen stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) transgenini taşıyan bir suş (örneğin, RW1596) elde edin.
NOT: Transgenin hayvanlara sokulması, transgeni zaten eksprese eden hayvanlarla bir ilgi türünü geçerek veya DNA'yı gonadın distal koluna mikroenjekte ederek sağlanabilir. Bu transgendeki rol-6 mutasyonunun neden olduğu 'yuvarlanma' fenotipi, kasların görselleştirilmesini kolaylaştırır. Vücut duvarı kasları, tipik olarak yan taraflarından birinde yattıkları için vahşi tip hayvanlarda normalde görülmesi engellenen sırt ve ventral taraflar boyunca uzanır. Rol-6 (su1006) aleli, hayvanların bükülmesine neden olur, böylece bazı kas hücrelerini görüntüleme için açığa çıkarır.
- Hayvanları yüksek çözünürlüklü şarjlı birleştirilmiş cihaz kamerası (CCD), 40X veya daha yüksek, GFP filtresi ve toplama yazılımı ile birleştirilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.
- Görüntülerin aşırı doygunluğunu önlemek için pozlama süresini ve aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın.
- Hayvanın en az bir tam görünür eğik kas hücresi içeren bir bölümünden kasların görüntülerini (400X büyütme) yakalayın ve kaydedin. Eksik olan tek bir kas hücresi olan bölgelerden veya odak dışı bölümlerden kaçının. Ayrıca aşırı ön ve arka bölgelerden ve vulvaya bitişik bölgelerden görüntüleri hariç tutun.
NOT: Hayvanın tek bir görünür tam kas hücresi yoksa, tam bir hücreyi ortaya çıkaracak şekilde hayvanı döndürmek için lamel hafifçe kaydırın.
- Kas hücre alanı ölçümü
- Görüntüyü Fiji yazılımında açın (bu çalışmada sürüm 2.0.0 kullanılmıştır).
- Tek bir eğik kas hücresinin etrafını dikkatlice izlemek için çokgen seçimini kullanın. İzlemeyi iyileştirmek için bağlantı noktasını sürükleyerek çokgenin sonundaki çizgiyi ayarlayın.
- Yazılımın üst kısmındaki Analiz sekmesine gidin ve seçim alanını hesaplamak için Ölç'e tıklayın. Alanı ve diğer ölçümleri içeren ayrı bir sonuç tablosu gösterilecektir. Sonuçlar tablosunda alan ölçümü eksikse, Analiz sekmesi altındaki Ölçümleri Ayarla'ya gidin ve alan kutusunun işaretli olup olmadığını kontrol edin. Aynı şekilde, gerekli olmayan diğer ölçümlerin işaretini kaldırın.
- Dejenere/eksik bölgeye sahip kas hücreleri için, eksik bölgeyi poligon seçim aracıyla izleyin ve tekrar Ölç'e tıklayın. Hücre içinde birden fazla boşluk varsa, her boşluğu ayrı ayrı izleyin.
- Boşluk alanının tüm tek kas hücresine oranını hesaplayın. Yüksek bir oran, hücre içindeki büyük boşluklar nedeniyle daha yüksek bir kas dejenerasyonu derecesini gösterir. Yabani tip hayvanlarda yaygın olarak görüldüğü gibi eksik bölge yoksa, oran sıfır olarak hesaplanacaktır.
NOT: Bir kontrol olarak, kas yapısı kusurlarını görsel olarak da puanlayın ve sonuçları kantitatif ölçümle karşılaştırın. Bu, özellikle suş laboratuvarda ilk kez inceleniyorsa kullanışlıdır. Fenotipik puanlama için, filamentlerin bütünlüğüne bağlı olarak hayvanları kusurlu veya kusurlu olmayan olarak değerlendirin. Örneğin, yapısal bozulma nedeniyle belirgin filament çizgileri kaybı, GFP topaklanması veya kas hücreleri içinde boşluklar olan hayvanlar kusurlu olarak puanlanacaktır.