Bu protokol, Xu ve Chisholm, C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).
1. Lazer Yaralama
NOT: Daha hassas yaralama yapmak için femtosaniye lazer ışınlaması (800 nm) kullanın.
- Eritilmiş %2 agar ile bir cam slayt üzerinde agar pedleri hazırlayın. Pedlerin, C. elegans'ın canlı görüntülenmesi için kullanılan agar pedlerine benzer olduğundan emin olun.
- 10 genç yetişkin solucanı solucan kazma ile agaroz pedine aktarın ve 2 μl'lik bir damla 12 mM Levamisol çözeltisi ekleyin. Hayvanları ve sıvıyı bir kapak fişi ile örtün. Solucanların felç olması için 1-2 dakika bekleyin.
- Cam slaytı dönen bir disk konfokal mikroskobu üzerine yerleştirin. Solucanları bulmak için sahneyi hareket ettirin ve 100X objektifle (NA 1.4-1.46) lateral anterior veya posterior sinsityal epidermise odaklanın.
- Femtosaniye lazerin gücünü 140 mW'a ayarlayın (objektiften önce ölçülmüştür). Femtosaniye lazeri 80 MHz.
tekrarlama hızında kullanın
NOT: Her biri 200 msn'lik iki darbe (20 msn ile ayrılmış) ellerimizde yaralama için yeterlidir.
- Epidermal hücrenin apikal yüzeyine odaklanın ve epidermisi yaralayın. Sitoplazmanın lokal olarak bozulmasını (köpürme) veya kullanılan herhangi bir floresan markörün lokal ağartılmasını gözlemleyin.
NOT: Femtosaniye lazeri kullanırken uygun lazer güvenlik prosedürlerini izleyin. İki foton mikroskobundakiler gibi femtosaniye lazerler kullanılarak yapılan çizgi veya nokta taramaları, lazer yaralama için yeterli gücü sağlamalıdır.
NOT: Diğer lazerleri kullanma konusunda doğrudan deneyimimiz olmasa da, prensip olarak geleneksel UV lazerler (C. elegans hücre ablasyonlarında kullanıldığı gibi) kullanılarak yaralama mümkün olmalıdır. İsteğe bağlı olarak, epidermisi sarmak için dönen disk konfokal üzerinde bir Fotobleaching Sonrası Floresan Geri Kazanımı (FRAP) modülü kullanın (N. Pujol, kişisel iletişim).
