FITC-Dekstran Besleme: C. elegans'ta Bağırsak Geçirgenliğini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Le, T. A. N., et al. Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerindeki Etkilerinin Ölçülmesi.J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, solucanları FITC etiketli dekstran besleyerek C. elegans bağırsak lümeninin bütünlüğünü görselleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sunar. Örnek protokol, 3,3'-diindolilmetan (DIM) ile muamele edilmiş ve patojenle beslenen solucanlarla yapılan testi göstermektedir.

Protokol

Bu protokol, Le ve ark. Bakterilerin ve Kimyasalların bir alıntıdır>Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. P. aeruginosa ile Beslenen C. elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Bir Kimyasalın (DIM) Etkilerini Test Etmek İçin NGM Plakalarının Hazırlanması
   1. 500 mL'lik bir cam şişeye (NGM agar) 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL damıtılmış su, manyetik bir karıştırıcı ve 6,8 g agar ekleyin.
   2. Başka bir 500 mL cam şişeye (NGM suyu) 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL damıtılmış su ve agar içermeyen manyetik bir karıştırıcı ekleyin.
   3. İki şişeyi (1.1-1.2 adımlarından), bir boş 100 mL cam şişeyi ve bir boş 500 mL cam şişeyi 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın. Ardından, orta boy şişeleri içeren şişeleri su banyosunda 30 dakika boyunca 55 °C'ye soğumaya bırakın. Agar ortamını su banyosunda tutun ve bir sonraki adım için et suyu içeren şişeyi (adım 1.2'den itibaren) çıkarın.
   4. Katkı maddelerini NGM et suyuna ekleyin: 0.4 mL 1 M CaCl₂, etanolde 0.4 mL kolesterol (mL), 0.4 mL 1 M MgS04 ve 10 mL 1 M KPO₄ (bu bileşenlerin tümü etanoldeki kolesterolden ayrı olarak sterilize edilmelidir). Daha sonra karışımı 55 °C'de manyetik bir karıştırıcı ile iyice karıştırın.
   5. Otoklavlanmış boş 500 mL cam şişeyi dimetil sülfoksit (DMSO) ile ve otoklavlanmış boş 100 mL cam şişeyi DIM ile etiketleyin.
   6. 50 mL NGM suyunu DIM etiketli 100 mL'lik şişeye aktarın. Şişeye 500 μL 20 mM DIM stoğu ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: DIM, DMSO'da (20 mM DIM stoğu) çözülür.
   7. NGM agar besiyerini su banyosundan hızlı bir şekilde çıkarın, DIM etiketli şişeye 50 mL NGM agar besiyerini ekleyin ve iyice karıştırın.
   8. Her 90 mm x 15 mm'lik Petri kabına 20 mL'lik bir DIM içeren NGM ortamı yerleştirin. Bu adımdan yaklaşık beş DIM içeren NGM plakası yapılabilir.
      NOT: Her bir NGM plakasındaki nihai DIM konsantrasyonu 100 μM olacaktır.
   9. DMSO içeren NGM plakasını hazırlamak için 150 mL NGM suyunu DMSO etiketli 500 mL'lik şişeye aktarın. Şişeye 1,5 mL DMSO ekleyin ve iyice karıştırın.
   10. DMSO etiketli şişeye 150 mL NGM agar ortamı ekleyin ve iyice karıştırın.
   11. Her 90 mm x 15 mm'lik Petri kabına 20 mL'lik bir DMSO içeren NGM ortamı yerleştirin. Bu adımdan yaklaşık on beş DMSO içeren NGM plakası yapılabilir.
       NOT: Her bir NGM plakasındaki nihai DMSO konsantrasyonu %0,5 olacaktır.
   12. Plakaları oda sıcaklığında en az 3 saat katılaştırın ve kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
       NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
   13. E. coli OP50 veya P. aeruginosa PAO1 kültürünü 4 ° C'lik buzdolabından çıkarın ve NGM plakalarına yaymadan önce kültürü uygun şekilde girdaplayın.
   14. Her taze NGM agar plakasına 800 μL E. coli OP50 veya P. aeruginosa PAO1 bakteri kültürü koyun ve plakaların gece boyunca 20 °C'lik bir inkübatörde kurumasını bekleyin.
       NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Üçüncü deney için (Şekil 1), canlı E. coli OP50 ile kaplanmış iki adet DMSO içeren NGM plakası, canlı P. aeruginosa PAO1 ile kaplanmış bir adet DMSO içeren NGM plakası ve canlı P. aeruginosa PAO1 ile kaplanmış bir adet DIM içeren NGM plakası hazırlanmıştır.
2. Bakterilerin Tedavisi veya DIM ve FITC-dekstran Besleme
   1. Yaşa senkronize yumurtaları, gıda olarak canlı E. coli OP50 ile takviye edilmiş NGM plakalarında 64 saat boyunca 20 ° C'de kuluçkaya yatırın.
   2. Yaşa senkronize L4 larvalarını S-tamponu ile yıkayın ve bunları (yaklaşık 500'den fazla solucan) farklı bakteri ve kimyasallar içeren tedavi NGM plakalarına aktarın. 20 °C'de 48 h.
      için inkübe edin NOT: Tedavi süresi, kullanılan bakteri ve kimyasallara göre 24 ila 72 saat arasında değişebilir. DIM'in terapötik veya önleyici etkisi, solucanların patojenlerle ön işlemden geçirilmesi ve daha sonra solucanların DIM ile tedavi edilmesiyle (terapötik etki) veya solucanların DIM ile ön işlemden geçirilmesi ve ardından patojenlerle tedavi edilmesiyle (önleyici etki) de değerlendirilebilir.
   3. FITC-dekstran takviyeli plakaları hazırlamak için, 2 mL ısıyla inaktive edilmiş E. coli OP50'yi 4 mg FITC-dekstran ile karıştırın. Daha sonra, 100 μL FITC-dekstran ve E. coli OP50 karışımını yirmi taze NGM agar plakasına (60 mm x 15 mm) bölün ve plakaların temiz bir tezgahta 1 saat kurumasını bekleyin.
      NOT: Her bir NGM plakasındaki FITC-dekstran'ın nihai konsantrasyonu 20 μg/mL olacaktır.
   4. Araç kontrol tedavisi için FITC-dekstran içermeyen beş E. coli OP50 içeren NGM plakası hazırlayın. Bu amaçla, 100 μL ısıyla inaktive edilmiş E. coli OP50'yi her bir taze NGM agar plakasına (60 mm x 15 mm) bölün ve plakaların temiz bir tezgahta 1 saat kurumasını bekleyin.
      NOT: Her bağımsız deney için, on beş FITC-dekstran takviyeli NGM plakası ve FITC-dekstran içermeyen beş NGM plakası gereklidir.
   5. 48 saatlik tedaviden sonra (adım 2.2'den itibaren), solucanları S-tamponu ile yıkayın, solucanları FITC-dekstran takviyeli plakalara ve FITC-dekstran içermeyen NGM plakalarına aktarın ve plakaları gece boyunca inkübe edin (14-15 saat).
      NOT: Her tedavi grubu için 5 kopya FITC-dekstran boyama (veya araç kontrol beslemesi) gereklidir.
   6. Solucanları S-buffer ile yıkayın ve taze NGM agar plakasında 1 saat
      süre boyunca sürünmelerine izin verin NOT: Her bağımsız deney için toplam 20 yeni NGM plakasına ihtiyaç vardır. Bu adımda, E. coli OP50 olmadan veya E. coli OP50 ile takviye edilmiş NGM plakasını kullanabilirsiniz.
   7. Siyah 96 oyuklu düz tabanlı bir plakanın her bir oyuğuna 50 μL %4 formaldehit çözeltisi ekleyin. Floresan ölçümleri için her bir NGM plakasından yaklaşık 50 solucanı her bir kuyucuğa aktarın. 1 ila 2 dakika sonra, her bir kuyucuktan tüm formaldehiti iyice çıkarın ve kuyucukları kaplamak için 100 μL montaj ortamı ekleyin.
      NOT: Formaldehit çözeltisi (%4) solucanları hareketsiz hale getirmek ve sabitlemek için kullanılır. Her tedavi grubu için görüntü analizi için 5 kuyucuk (5 tekrar) kullanılır.
3. C. elegans'ın Operetta Görüntüleme Sistemi ile Görüntülenmesi ve FITC-dekstran Floresan Tutulumunun Ölçülmesi ile Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi
   NOT:Görüntü analizi için Operetta sistemi yerine floresan stereomikroskopi kullanılabilir.
   1. Operetta Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemini kullanarak floresan görüntüleri yakalayın ve floresan yoğunluğunu ölçün ve görüntüleri Harmony yazılımı ile analiz edin.
   2. Harmony yazılımında, kapağı açmak ve plakayı makineye koymak için Kapağı aç simgesine basın.
   3. Parametreleri ayarlayın.
   4. Ayarla'ya tıklayın, plaka tipini seçin (96 kuyulu Corning düz tabanlı) ve kanalları ekleyin (parlak alan ve EGFP kanalları).
   5. Düzeni ayarlayın. Düzen seçimine gidin ve ardından İzle'yi seçin ve parametreleri ayarlayın (ilk resim 1 μm, düzlem sayısı 10, mesafe 1 μm).
   6. Tedavi kuyularından birini ve bir yakalama alanını seçin ve Deneyi çalıştır bölümünde resimlerin tatmin edici olup olmadığını kontrol etmek için Test Et'e basın.
   7. Resimler tatmin ediciyse, Kurulum bölümüne dönün ve ekranın sonundaki Sıfırla simgesine basın. Ardından, tüm hedef kuyuları ve uygun sayıda yakalama alanını seçin.
   8. Deneyi çalıştır'a tekrar gidin ve plaka adını girin, ardından işlemeye başlamak için Başlat'a basın.
   9. Floresansın yoğunluğunu ölçmek için görüntü analizi bölümüne gidin ve görüntüyü girin. Ortak eşiği 0,5'e, alanı >200^μm2'ye, bölme faktörünü 3,0'a, bireysel eşiği 0,18'e ve kontrastı 0,18'den fazla olarak ayarlayarak hücreyi bulun. Ardından, yoğunluk özelliklerini hesaplayın ve çıktı olarak ortalamayı seçin. Kurulumu kaydetmek için Uygula simgesine basın.
   10. Bir ısı haritası ve veri tablosu elde ederek yoğunluğu ölçmek için Değerlendirme bölümüne gidin. Okuma parametresini Hücreler — Yoğunluk, Hücre EGFP Ortalaması — Kuyu Başına Ortalama olarak ayarlayın ve değerlendirmeyi başlatın.
       NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
   11. Verileri Operetta'dan çıkarmak için Ayar düğmesine tıklayın ve Veri yönetimi'ni seçin.
   12. Arşiv yaz'ı seçin ve ardından gözatmayı açın ve dosyayı seçin.
   13. Dosyayı seçmek için sol köşedeki küçük + işaretine tıklayın ve ardından Ölçüm'e tıklayın ve Plaka adı'nı seçin.
   14. Dosyayı seçin ve Tamam'a tıklayın.
   15. Etkin yoldaki Gözat sinyaline tıklayarak dosyayı kaydetmek için yolu seçin.
   16. Verileri kaydetmek için Başlat'a tıklayın file.
       NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
4. C. elegans'ın FITC-dekstran Floresansının İstatistiksel Analizi
   1. Verileri içe aktarın ve bir istatistik yazılımı kullanarak ortalama ve standart sapmayı (SD) hesaplayın.
   2. Tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile anlamlı farkı analiz edin.

Sonuçlar

Şekil 1: DIM'in P. aeruginosa ile beslenen C. elegans'ın bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkisi.(A) FITC-dekstran beslemeli olmayan E. coli OP50, (B) FITC-dekstran beslemeli E. coli, (C) FITC-dekstran beslemeli P. aeruginosa PAO1 ve (D...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3,3'-diindolilmetan	Sigma	D9568
90×15 mm Petri kapları	SPL Yaşam Bilimleri, Güney Kore	10090
Aktör Ağar	Beckton Dickinson'ın fotoğrafı.	REFERANS 214010
Formaldehit çözeltisi	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)		Vahşi tip
Kolesterol	Sigma	C3045
Costa Tahlil Plakası, 96 Kuyulu Siyah, Şeffaf Düz Dipli, İşlenmemiş, Kapaksız Polistiren	Corning Anonim Şirketi	REFERANS 3631
Dimetil sülfoksit	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)
Floresein izotiyosiyanat - dekstran	Sigma	FD10S Serisi
Harmony yazılımı	PerkinElmer		Sürüm 3.5
Magnezyum sülfat heptahidrat	Fisher Biyoreaktifleri	BP2213-1
Florürlü sulu montaj ortamı	Sigma	F4680
Operetta CLS Yüksek İçerikli Analiz Sistemi	PerkinElmer	HH16000000
Pepton	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Tip Kültürü için Kore Koleksiyonu	KCTC NO. 1637
Sodyum Klorür	Fisher Biyoreaktifleri	BP358-1
Stereo Mikroskop	Nikon, Japonya	SMZ800N