$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Aşağıdaki protokol, Farboud ve ark. Çeşitli Hücrelerde ve Organizmalarda Cas9 Ribonükleoprotein ile Gelişmiş Genom Düzenleme, J. Vis. Exp.(2018).
1. RNP Derlemesi
- Deneyi önceden tasarlayın, tüm RNA, DNA ve protein bileşenlerini önceden edinin. İlk geçiş olarak, Tablo 1'de listelenen pozitif kontrollerden birini deneyin ve güvenilir bir deneysel tasarım ve malzemelerin bütünlüğünü sağlamak için Malzeme Tablosunda açıklanan ticari reaktifleri kullanın. Yeni bir genom düzenleme deneyi planlamaya ilişkin ek ipuçları için, bu konuyla ilgili makalelere bakın.
NOT: Sonraki adımlarda açıklandığı gibi bir araya getirildikten sonra, önceden hazırlanan RNP'ler -80 °C'de saklanabilir.
- Hangi geni hedefleyeceğinizi seçtikten sonra, optimal bir gRNA tasarlamak için ücretsiz çevrimiçi araçlardan birini kullanın. Bir nakavt oluşturmayı umuyorsanız bir eksonu hedeflediğinizden emin olun.
NOT: Bu araçlar, bitişik bir S. pyogenes PAM dizisi, yüksek kalite puanı ve düşük hedef dışı skoru olan bir hedef siteyi tanımlamaya yardımcı olacaktır.
- S. pyogenes Cas9 proteinini yayınlanmış yöntemlerle saflaştırın veya ticari bir satıcıdan satın alın.
- RNA seyreltmesi, RNP hazırlığı ve protein depolaması için 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, %10 gliserol ve 10 mM TCEP içeren tipik bir Cas9 tamponu hazırlayın. Bozulmayı önlemek için RNA'yı yeniden süspanse etmek veya seyreltmek için kullanılacak tamponlarda her zaman nükleaz içermeyen su kullanın.
- Yayınlanmış yöntemleri kullanarak in vitro transkripsiyon yoluyla kılavuz RNA'yı (tracrRNA ve crRNA veya sgRNA) üretin veya bir nükleik asit sentezi şirketinden satın alın.
- Bir gen ekliyorsanız, bir donör DNA şablonu sentezleyin veya satın alın.
- Protein ve RNA alikotlarını -80 °C'de saklayın ve kullanmadan hemen önce buz üzerinde çözdürün.
NOT: Her donma-çözülme verimliliği biraz düşürür. Cas9 saflaştırması ve sgRNA'ların in vitro transkripsiyonu için ayrıntılı, açık erişimli protokoller başka yerlerde mevcuttur.
- C. elegans düzenlemesi için RNP hazırlığı: 20 μL'lik bir nihai hacim oluşturmak için aşağıdaki reaktifleri ekleyerek RNP kompleksini birleştirin (nihai konsantrasyonlar parantez içinde belirtilmiştir): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7.5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM), ve gerekirse onarım şablonları (0,5 μM ssDNA veya 350 ng/μL dsDNA'ya kadar).
NOT: Cas9 aracılı DSB şablonlu onarımın verimliliği, dsDNA onarım yapısının konsantrasyonu ile orantılıdır; Bu nedenle, onarım şablonunun konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, şablonlu onarım o kadar verimli olur. Bununla birlikte, 350 ng / μL'den fazla dsDNA içeren bir karışım enjeksiyonunun, enjekte edilen solucanların canlılığını azalttığı gösterilmiştir. Bu nedenle, ölümcüllüğünü en aza indirirken onarım verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için karışımda en fazla 350 ng/μL dsDNA kullanmak en iyisidir.
- Ko-CRISPR/ko-dönüşüm tarama yaklaşımı için gerektiği gibi, aynı anda birden fazla lokusu hedeflemek için birden fazla crRNA ekleyin. Birden fazla crRNA eklerken, her birini sırayla ana karışıma ekleyin.
NOT: Her crRNA'nın miktarının aynı olması gerekmez ve Cas9 konsantrasyonunu değiştirmeden ana karışımdaki toplam crRNA konsantrasyonunu iki katına çıkarmak bile belirli bir lokustaki mutajenez sıklığına müdahale etmiyor gibi görünmektedir. Örnekler Paix ve ark.
- Pipetleme ile karıştırın ve çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için RNP çözeltisini 16.000 x g'da 5 saniye boyunca döndürün.
- Çözeltiyi 37 ° C'de 15 m inkübe edin.
- İnce delikli mikroenjeksiyon iğnesini tıkayabilecek partikülleri peletlemek için numuneyi 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Sonraki adımlarda süpernatanı kullanın.
- C. elegans Hazırlanışı
1. Mikroenjeksiyondan 1 gün önce: Mikroenjeksiyon için agaroz pedleri hazırlayın.
- Suya agaroz ekleyerek ve çözeltiyi sıcak bir tabakta veya mikrodalgada kaynatarak suda% 3 (a/h) agaroz çözeltisi yapın.
- Bir masanın üzerine 24 mm x 50 mm x 1,5 mm boyutunda cam slaytlar yerleştirin ve slaytın üzerine küçük (~ 15 μL) bir damla agaroz çözeltisi yerleştirmek için bir cam Pasteur pipeti kullanın. Üstüne başka bir lamel koyarak agaroz damlasını hızla düzleştirin. Agarozun katılaşmasına izin verin ve ardından lamellerden birini çıkarın.
- Agaroz kaplı lamel yüzü yukarı bakacak şekilde kuruması için bir gece boyunca masa üstünde bırakın. 24 saat sonra agaroz pedlerini temiz ve kuru bir kapta saklayın.
NOT: Bunlar süresiz olarak kullanılabilir.
2. Mikroenjeksiyon iğnelerini çekin: filamentli borosilikat cam kılcal damarlar (dış çap 1.0 mm ve iç çap 0.58 mm) kullanarak, Mello ve Fire57 ve diğer kaynaklara dayalı iğneleri çekin. İğneler hemen kullanılabilir veya kil desteklerle desteklenmiş temiz, kuru bir kapta saklanabilir.
3. Solucanların bakımı için, Petri plakalarına dökülen ve OP50 bakterileri ile lekelenmiş bir Nematod Büyüme Ortamı (NGM) agar hazırlayın (standart C. elegans bakımı ve büyüme ortamı tarifleri ile ilgili protokoller için bkz.
4. Mikroenjeksiyon için solucanları hazırlayın: Mikroenjeksiyondan 12-24 saat önce, L4 aşamalı hermafroditleri OP50 bakterili yeni bir NG-agar plakasına alın ve gece boyunca 20 °C'de inkübe edin. Her Cas9 hedef / enjeksiyon karışımı için plakaya ~ 30 solucan seçin.
- Yüklenen iğneyi bir mikromanipülatöre bağlı mikroenjeksiyon aparatına monte edin. Enjeksiyon aparatı basıncını 250 kPa'ya ve denge basıncını 25 kPa'ya ayarlayın.
- Keskin bir iğne kenarı oluşturmak için yüklü iğne ucunu geri kırın. 24 mm x 50 mm x 1,5 mm boyutlarında bir lamel üzerine 15 mm x 1,5 mm x 1,5 mm kare lamel yerleştirin.
- Kare lamellerin bir kenarını halokarbon yağı 700 ile kaplayın.
- İğneyi yağın içine, 15 mm kare lamel kenarına yerleştirin.
- Mikroskop tablasını ve lamel kılavuzunu yönlendirmek için bir elinizi kullanarak, enjeksiyon pedalına/düğmesine basarken sürgüyü iğnenin kenarı boyunca yukarı ve boyunca fırçalayın. İğne ucunu geriye doğru kırın, sıvının iğneden dışarı akışını artırın. Enjeksiyon karışımının iğnenin kenarı boyunca yukarı akmasını sağlayarak ~1 kabarcık/sn oluşturarak optimum bir akış hızı elde edin.
- Mikroenjeksiyondan 12-24 saat önce toplanan L4 solucanlarının, enjeksiyon gününde gelişimsel olarak evrelenmiş genç yetişkinler olduğunu onaylayın. Genç yetişkin solucanları OP50 bakteri içermeyen bir NG-agar plakasına alın ve 5 dakika boyunca etrafta gezinmelerine izin verin. Bu, enjeksiyon pedine aktarılan bakteri miktarını azaltarak iğne tıkanmalarını en aza indirir.
- Diseksiyon dürbünü üzerine bir agaroz enjeksiyon pedi/lamel yerleştirin. Bir solucan penası kullanarak, pedin bir kenarı boyunca küçük bir halokarbon yağı parçası yerleştirin.
- Yağla kaplanmış solucan kazmasını kullanarak, birkaç solucanı NG-agar plakasından kaldırın ve yağ izine doğru kaldırın. Kirpik veya kedi bıyığı gibi bir pipete bağlı ince bir saç ile, solucanları paralel olarak konumlandırın ve solucanları nazikçe agaroz pedine itin. Mikroenjeksiyon prosedürü ile rahat olana kadar, bir seferde sadece bir solucan monte edin ve enjekte edin.
NOT: Kuru agaroz, solucanlardaki nemi emerek pede yapışmalarına neden olur. Sonuç olarak, solucanlar kuruyabileceğinden hızlı bir şekilde çalışılmalıdır.
- Yerleştirildikten ve pede takıldıktan sonra, solucanları solucan penasının ucundan birkaç damla halokarbon yağı (~ 20 μL) ile kaplayın.
- C. elegans RNP'ler ve Enjeksiyon Sonrası Bakım ile Gonad Mikroenjeksiyonu
Mikroenjeksiyon protokolü Mello ve Fire'dan uyarlanmıştır ve başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Lamel monte edilmiş sonsuz vidalarla birlikte enjeksiyon mikroskobunun üzerine yerleştirin. Düşük büyütme altında (5X objektif, 10X oküler), solucanları enjeksiyon iğnesine dik olarak konumlandırın.
- Yüksek büyütmeye geçin (40X objektif, 10X oküler), orta ila geç pakitende çekirdeğe yakın bölgeye karşılık gelen gonad kolunun yanındaki iğneyi yeniden konumlandırın.
- Mikromanipülatörü kullanarak, kütikülü hafifçe bastırarak iğneyi solucana karşı hareket ettirin. Ardından, bir elinizle, iğneyi kütikülden geçirmek için mikroskop aşamasının yan tarafına hafifçe vurun. Enjeksiyon pedalına/düğmesine basın ve gonad kolunu enjeksiyon karışımıyla yavaşça doldurun ve iğneyi çıkarın.
- Bu adımı diğer gonad kolu ile tekrarlayın.
- Solucanlar enjekte edildikten sonra, lamel / agaroz pedini çıkarın ve bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
- Çekilmiş bir kılcal pipet kullanarak, üzerlerine bir M9 tamponu pipetleyerek yağı solucanlardan uzaklaştırın. Solucanları agardan serbest bırakmak için bu tedaviyi uygulayın.
- 10 dakika sonra, solucanlar tamponda çırpınırken, çekilmiş kılcal pipeti kullanarak onları OP50 bakterili bir NG-agar plakasına taşıyın. Solucanlar iyileşene ve hareket etmeye başlayana kadar plakayı 20 °C'de 2-3 saat yerleştirin.
- Geri kazanıldıktan sonra, solucanları OP50 ile NG-agar plakalarına ayrı ayrı aktarın ve plakaları 25 ° C'lik bir inkübatöre aktarın.
- P 0 enjekte edilen solucanların büyümesine ve 3 gün boyunca döl bırakmasına izin verin. F 1 yavrularını eleyin.
- Ko-CRISPR veya ko-dönüşüm kullanılıyorsa, referans genin mutant fenotipine sahip olup olmadıklarına bağlı olarak tarama için aday solucanları seçin. Bu işaretli solucanları OP50 ile yeni NG-agar plakalarına ayrı ayrı aktarın ve 20 °C.
'de F2 döllerini bırakmalarına izin verin
NOT: Bir ko-CRISPR taraması veya seçimi için kullanılan fenotip, Cas9 düzenlemesinin başarısı için erken bir tahmin sağlamalıdır.
- Ko-CRISPR fenotipi mevcut değilse, mikroenjeksiyon verimliliğini artırmaya yardımcı olmak için pozitif bir kontrol plazmidi mikroenjekte edin.
NOT: Örneğin, mCherry etiketli MYO-2'yi kodlayan enjeksiyon karışımına bir plazmid dahil etmek, enjeksiyon verimliliğinin değerlendirilmesine yardımcı olacaktır. Başarılı bir şekilde pCFJ90 enjekte edilen solucanlar, floresan farenksli bazı yavrulara sahip olacaktır.
- İstenen düzenlemelerin varlığı için F1 solucanlarını inceleyin. F1 annesini 96 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna seçin, onu parçalayın ve DNA'sını insert-spesifik PCR amplifikasyonu, DNA dizi analizi veya araştırmacı nükleaz testi (CEL-1) ile inceleyin.
NOT: Bu tahliller, bir ko-CRISPR / ko-dönüşüm veya diğer tarama veya seçim rejimleri kullanılırken gerçekleştirilebilir.
