UV Işınlaması: Kromozomal Dışı Dizileri Entegre Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Mariol, M. C et al. Yüksek İletim Hızına Sahip Kromozomal Dışı Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek için Hızlı Bir Protokol.J. Vis. Uzm.(2013).

Transgenlerin mikroenjeksiyonu genellikle büyük ekstrakromozomal dizilere sahip C. elegans suşları ile sonuçlanır, bu da transgenin değişken ekspresyonu ve iletimi ile sonuçlanır. UV Işınlaması, dizinin kromozomal entegrasyonunu ve daha kararlı transgen iletimini indükleyebilir.

Protokol

Bu protokol, Mariol ve ark., Yüksek İletim Hızına Sahip Kromozomal Dışı Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol, J. Vis. Exp.(2013).

1. UV Işınlaması ve Transgenik Solucanların Geri Kazanımı

1. Solucan ışınlaması:
   1. 30-100 floresan transgenik L4 hayvanını ayrı kültür plakalarına seçin (plaka başına 15-20 hayvan).
   2. Plakaları, kapakları çıkarılmış olarak bir UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin. Solucanları 0.012 J /^cm2'de ışınlayın. Suşların UV'ye az ya da çok duyarlı olduğunu ve sonuçların kullanılan UV ışınlayıcıya bağlı olarak değişebileceğini unutmayın. 0.010-0.015 J /^cm2 arasında bir doz aralığı test edilebilir.
2. Işınlamadan sonra solucan geri kazanımı:
   1. Geri kazanım için ışınlanmış solucanların bulunduğu plakaları gece boyunca 15 ° C'de yerleştirin.
   2. Canlı olan hayvanların sayısını kontrol edin. Elimizde, verimli bir ışınlama için yaklaşık %80-90'lık bir sağkalım oranı uyarlanmıştır.
   3. Işınlanmış hayvanları, döl gelişim aşamasına ulaşana kadar 15-25 ° C'de büyütün ve koenjeksiyon belirteç ifadesinin gözlemlenmesine izin verin.

2. Entegre Transgenik Hatların İzolasyonu

1. F1 hayvanlarının seçimi:
   1. Tek 150-200 floresan F1 hayvanlarını ayrı kültür plakalarına. Yüksek iletimli hatlar için (% ≥80), 100 F1 hayvanı yeterlidir.
   2. Bu F1 plakalarını, döl floresan F2 hayvanlarının gözlemlenmesi için uygun bir aşamaya gelene kadar 15-25 °C'de tutun.
   3. i) F1 hayvanının kısır olduğunu veya öldüğünü gösteren hiçbir döl göstermeyan veya ii) F1 hayvanının transgeni beklenen oranda iletmediğini gösteren floresan F2 hayvanı olmayan veya sadece birkaç floresan F2 hayvanı sergileyen tüm F1 plakalarını atın. Bu adım hızlıdır ve %≥75 floresan döl sergileyen F1 plakalarını seçmek için floresan F2 solucanlarının yüzdesinin tahmin edilmesini gerektiren standart protokolle karşılaştırıldığında gerçek bir avantajı temsil eder (Tablo 1).
2. F2 hayvanlarının seçimi:
   1. Seçilen her F1 plakasından tek dört floresan transgenik F2 hayvanı. Floresan transgenleri (örneğin mCherry, gfp veya dsRed) kullanırken, yüksek düzeyde floresan içeren F2 solucanlarını seçin, çünkü bu, bu hayvanların entegre dizi için homozigot olduğunu gösterebilir. F2 hayvanlarını toplarken, bir sonraki adımda yanlış negatiflerden kaçınmak için yumurta veya larva taşımamanın çok önemli olduğunu unutmayın.
   2. F2 hayvanlarını 15-25 °C'de büyütün.
3. Entegre transgenik suşların izolasyonu ve validasyonu:
   1. % 100 floresan transgenik F3 solucanları için ekran F2 plakaları. Floresan olmayan tek bir solucanın varlığı plakanın atılması gerektiğini gösterdiğinden ekran oldukça hızlıdır. Entegre transgen için homozigot bir F2 hayvanı, %100 homozigot floresan döl verecektir.
   2. Transgenin %100 kalıtımını doğrulamak için seçilen plakalardan tek sekiz floresan F3 hayvanı. Teorik olarak, bu adımda bir hayvan seçmek yeterlidir. Bununla birlikte, ışınlama, solucan fizyolojisi için önemli olan genleri etkileyen mutasyonları rastgele indükleyebileceğinden, verimsiz veya sağlıksız hayvanları seçmekten kaçınmak için sekiz floresan F3 hayvanının seçilmesi gerekli olabilir.
   3. Mümkünse, birkaç bağımsız entegre transgenik suşu, yani farklı F1 hayvanlarından geri kazanılan suşları saklayın.

Sonuçlar

Tablo 1. Ekstrakromozomal dizilerin C. elegans genomuna entegrasyonu için standart ve geliştirilmiş protokollerin karşılaştırılması.Yaklaşık aynı frekansta iletim yapan iki entegre olmayan transgen, standart veya geliştirilmiş protokol kullanılarak entegre edildi. Temel fark, standart protokolde,% 75'in ≥ olması gereken transgenik F2 solucanlarının yüzdesini tahm...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
U.V. çapraz bağlayıcı	Fischer Scientific		Dalga boyu 254 nm
Mikroskop SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri kapları, 60 mm	Kml	BPS55E6
Platin tel 0,25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	Solucanlar için bir seçim yapmak için