$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. İnsan Meme Kanseri Hücre Hatlarından Primer Mamosferlerin Üretilmesi
NOT: Steril bir kültür başlığı altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin, 100 U/ml streptomisin ile takviye edilmiş DMEM/F12 içeren Mamosfer Ortamı hazırlayın. Kullanmadan hemen önce 20 ng/ml rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF; Sigma), 10 ng/ml rekombinant insan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF; Ar-Ge Sistemleri) ve 1x B27 eki.
- Yapışkan MCF-7 veya MDA-MB-231 hücreleri (veya seçtiğiniz bir meme kanseri hücre hattı; %70-80 birleşme) içeren şişeden aspire edin, 1x PBS'de iki kez yıkayın ve hücreleri tripnize edin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı boşaltın ve hücreleri 1-5 ml mamosfer ortamında yeniden süspanse edin. Yukarı ve aşağı pipetleyin ve gerekirse tek hücreli süspansiyon elde etmek için 40 μm'lik bir hücre süzgeç kapağı filtresi kullanın. Tek bir hücre süspansiyonunun oluştuğundan emin olmak için bir hemositometre kullanın (değilse, hücre süspansiyonunu 3 defaya kadar şırınga etmek için 25 G'lik bir iğne kullanın).
- Gerekirse, anti-CD24-fikoeritrin (PE) ve anti-CD44-floresein izotiyosiyanat (FITC) monoklonal antikorları 9 kullanarak FACS yoluyla CD44 + CD24- hücresel alt kümesini izole edin. Alternatif olarak, üreticinin talimatlarına göre anti-CD44 ve anti-CD24-biyotin kombine mikro boncuklar içeren manyetik ile aktive edilmiş bir hücre sıralama (MACS) sistemi kullanarak bu popülasyonu izole edin. LS sütunlarını kullanarak pozitif seçim ve LD sütunlarını kullanarak negatif seçim yapın ve izole edilen tüm hücrelerin fenotiplerini akış sitometrisi ile onaylayın.
- Tripan mavisi kullanarak ml başına canlı hücre sayısını hesaplayın.
not: Hücre canlılığı, canlı hücre sayısının hemositometre üzerindeki ızgaralar içindeki toplam hücre sayısına bölünmesiyle hesaplanır. Tripan mavisi alan hücreler cansız olarak kabul edilir. Canlı hücrelerin oranını doğru bir şekilde belirlemek için aşağıdaki prosedür kullanılır.
- PBS'de% 0.4'lük bir tripan mavisi çözeltisi hazırlayın. 1 ml hücreye 0.1 ml tripan mavisi stok çözeltisi ekleyin. Bir hemositometre yükleyin ve hemen düşük büyütme oranında mikroskop altında inceleyin. Toplam hücre sayısını ve mavi lekeli hücre sayısını sayın. Canlı hücreler = [1.00 - (Mavi hücre sayısı ÷ toplam hücre sayısı)] × 100.
- Ml kültür başına canlı hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın. Seyreltme faktörünü düzeltmeyi unutmayın.
Canlı hücre sayısı ×10 4 × 1.1 = hücre/ml kültür
- 6 oyuklu ultra düşük yapışkan bir plakanın her bir oyuğunda 2 ml tam mamosfer ortamında önceden belirlenmiş miktarda hücreyi yeniden süspanse edin. Tohumlama yoğunluğu normalde kuyu başına 500-4.000 hücre / cm2 hücredir. İsteğe bağlı olarak, hücreleri 0,5 ml ortamda aynı yoğunlukta tohumlarken düşük bağlantılı 24 oyuklu plakalar kullanın.
not: İlgilenilen her hücre hattı için tohumlama yoğunluğunun ve kültür zamanının optimizasyonunu öneririz.
- Ultra düşük bağlantılı 6 oyuklu plakaları 37 °C ve %5 CO2'de 5-10 gün boyunca (hücre hattına ve mamosferlerin boyutuna bağlı olarak) plakaları rahatsız etmeden, özellikle ilk 5 günün büyüme aşamasında inkübe edin.